高美華醫(yī)學(xué)免疫學(xué)-補體結(jié)合實驗ppt課件

1、50%溶血實驗溶血實驗 50% complement hemolysis, CH50測定血清總補體測定血清總補體活性活性 一、實驗原理一、實驗原理 補體最重要的活性是溶細(xì)胞作用。特異性補體最重要的活性是溶細(xì)胞作用。特異性抗體與紅細(xì)胞結(jié)合可激活補體引起溶血，溶血抗體與紅細(xì)胞結(jié)合可激活補體引起溶血，溶血程度與補體的活性相關(guān)。溶血反響對補體的劑程度與補體的活性相關(guān)。溶血反響對補體的劑量依賴呈一特殊的量依賴呈一特殊的S形曲線，該曲線在形曲線，該曲線在30%70%之間最陡，幾乎呈直線，即此階段之間最陡，幾乎呈直線，即此階段對補體量的變化非常敏感，因此實驗常以對補體量的變化非常敏感，因此實驗常以50%溶血

2、作為判別終點來測定血清總補體活性，這溶血作為判別終點來測定血清總補體活性，這一方法稱為補體一方法稱為補體50%溶血實驗溶血實驗 CH50 。二、試劑二、試劑1、綿羊紅細(xì)胞、綿羊紅細(xì)胞SRBC：無菌采靜脈血，除：無菌采靜脈血，除去纖維蛋白后，洗滌配成去纖維蛋白后，洗滌配成2%濃度運用。濃度運用。2、溶血素：抗綿羊紅細(xì)胞抗體，需提純后滅活、溶血素：抗綿羊紅細(xì)胞抗體，需提純后滅活補體。用稀釋緩沖液稀釋至補體。用稀釋緩沖液稀釋至2單位。單位。3、稀釋緩沖液：、稀釋緩沖液： PH7.4巴比妥緩沖液巴比妥緩沖液 三、方法1、待檢標(biāo)本的處置： 取試管一支加待測血清0.20ml，參與3.80ml pH7.4巴

3、比妥緩沖液，使血清為1：20稀釋。2、取1列10支試管，從110編號，第19為測定管，第10管為對看管。按表進(jìn)展加樣。3、50%溶血規(guī)范管 全溶管：2%SRBC 1ml+4ml蒸餾水混勻靜置10min 50%溶血管：2ml全溶管液體+2ml pH7.4巴比妥緩沖液。4、上述一切試管經(jīng)2500rpm，離心5min后，與50%溶血管肉眼初步比較，取較接近的2管進(jìn)展比色，確定最接近50%溶血管的管號。四、結(jié)果判別：四、結(jié)果判別：根據(jù)最接近根據(jù)最接近50%溶血管的管號，查出該管所加待溶血管的管號，查出該管所加待檢血清標(biāo)本量，按以下公式計算：檢血清標(biāo)本量，按以下公式計算：CH50U/ml=1/ 50%溶

4、血管的血清用量溶血管的血清用量ml稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)正常范圍：正常范圍：50100 U/ml 補體結(jié)合實驗補體結(jié)合實驗complement fixation test，CFT 一、原理一、原理 Ag和相應(yīng)和相應(yīng)Ab反響所構(gòu)成的免疫復(fù)合反響所構(gòu)成的免疫復(fù)合物物IC能吸附固定并激活補體。能吸附固定并激活補體。5種成份分屬于：反響系統(tǒng)；補體系種成份分屬于：反響系統(tǒng)；補體系統(tǒng)；指示系統(tǒng)。統(tǒng)；指示系統(tǒng)。 反響、指示系統(tǒng)競爭結(jié)合補體系統(tǒng)。反響、指示系統(tǒng)競爭結(jié)合補體系統(tǒng)。先參與反響系統(tǒng)，優(yōu)先結(jié)合補體。假設(shè)先參與反響系統(tǒng)，優(yōu)先結(jié)合補體。假設(shè)反響系統(tǒng)中待測的反響系統(tǒng)中待測的Ab或或Ag與知與知Ag或或Ab相對應(yīng)，

5、那么相對應(yīng)，那么Ag與與Ab構(gòu)成構(gòu)成IC后可結(jié)合補體；再參與指示系統(tǒng)時，因后可結(jié)合補體；再參與指示系統(tǒng)時，因已沒有游離的補體而不出現(xiàn)溶血，為補已沒有游離的補體而不出現(xiàn)溶血，為補體結(jié)合實驗陽性。假設(shè)不相對應(yīng)，將會體結(jié)合實驗陽性。假設(shè)不相對應(yīng)，將會有游離的補體參與指示系統(tǒng)的反響，最有游離的補體參與指示系統(tǒng)的反響，最終會出現(xiàn)溶血景象，為陰性。終會出現(xiàn)溶血景象，為陰性。補體結(jié)合實驗圖示補體結(jié)合實驗圖示受檢系統(tǒng)受檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)指示系統(tǒng)溶血反響溶血反響補體結(jié)合實驗補體結(jié)合實驗1、僅有抗原或抗體、僅有抗原或抗體補體補體紅細(xì)胞紅細(xì)胞溶血素溶血素陽性陽性陰性陰性2、抗原抗體反響、抗原抗體反響紅細(xì)胞紅細(xì)胞溶血素溶

6、血素陰性陰性陽性陽性抗原抗體補體補體抗原抗原/抗體抗體二、試劑二、試劑1、受檢抗原、抗血清、受檢抗原、抗血清56 30min滅活，滅活，1:50稀釋。稀釋。2、補體豚鼠新穎血清，、補體豚鼠新穎血清，2u、1%綿綿羊紅細(xì)胞羊紅細(xì)胞SRBC、溶血素、溶血素2u。3、生理鹽水、試管、吸管、水浴箱等。、生理鹽水、試管、吸管、水浴箱等。 三、方法1、溶血素效價的滴定按照下表操作以顯示全溶的溶血素最高稀釋度作為溶血素的效價。在補體結(jié)合實驗時，溶血素的效價也稱之為1個溶血素單位，在正式實驗時普通采用2個溶血素單位。管管 溶血素溶血素 2 單位單位 pH 7.4巴巴 2羊羊 號號 稀釋度稀釋度溶血素溶血素補補

7、 體體 比妥緩沖比妥緩沖紅細(xì)胞紅細(xì)胞假定結(jié)果假定結(jié)果 1 1:300 0.25 0.15 0.85 0.25 放放全溶全溶2 1:400 0.25 0.15 0.85 0.25 置置全溶全溶3 1:500 0.25 0.15 0.85 0.25 37全溶全溶4 1:600 0.25 0.15 0.85 0.25 全溶全溶5 1:800 0.25 0.15 0.85 0.25 水水全溶全溶6 1:1000 0.25 0.15 0.85 0.25 浴浴全溶全溶7 1:1200 0.25 0.15 0.85 0.25 30全溶全溶8 1:1600 0.25 0.15 0.85 0.25 分分微溶微溶

8、9 1:2000 0.25 0.15 0.85 0.25 鐘鐘微溶微溶10 1:2400 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶11 1:3200 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶12 1:4000 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶13 1:4800 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶14 1:6400 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶不溶2、補體滴定：普通用豚鼠補體，每次實驗前均、補體滴定：普通用豚鼠補體，每次實驗前均應(yīng)滴定應(yīng)滴定按照下表操作按照下表操作以能產(chǎn)生完全溶血的最少量的補體為以能產(chǎn)生完全溶血的最少量的補體為1個個“

9、恰定單恰定單位，全溶第位，全溶第2管為管為1個個“適用單位。正式實適用單位。正式實驗時運用驗時運用2個適用單位。個適用單位。補補 體體 效效 價價 滴滴 定定 管管號號1:60補體補體(ml)pH 7.4巴巴比妥緩比妥緩沖液沖液(ml)稀釋抗稀釋抗原原(ml)注注1%致敏羊致敏羊紅細(xì)胞紅細(xì)胞(ml)注注假定結(jié)果假定結(jié)果10.010.290.1放放置置37水水浴浴10min0.2放放置置37水水浴浴30min不溶血不溶血20.020.280.10.2不溶血不溶血30.030.270.10.2不溶血不溶血40.040.260.10.2微溶血微溶血50.050.250.10.2微溶血微溶血60.06

10、0.240.10.2全溶（全溶（1個恰定個恰定單位）單位）70.080.220.10.2全溶（全溶（1個實用個實用單位）單位）80.100.200.10.2全溶全溶90.120.180.10.2全溶全溶100.150.150.10.2全溶全溶注注: : 為了排除抗原或抗體的抗補體作用，需在補體滴定的為了排除抗原或抗體的抗補體作用，需在補體滴定的同時參與抗原或抗體如待檢系統(tǒng)中以抗原測定未知同時參與抗原或抗體如待檢系統(tǒng)中以抗原測定未知抗體，需參與抗原，反之那么加抗體?？贵w，需參與抗原，反之那么加抗體。注注: : 指稀釋好的每指稀釋好的每2 2單位溶血素與等量單位溶血素與等量2 2綿羊紅細(xì)胞懸液綿羊

11、紅細(xì)胞懸液混合，置室溫作用混合，置室溫作用20203030分鐘即可。分鐘即可。 效價計算：從上表可以看出：效價計算：從上表可以看出：0.06ml 1:60稀釋的補體為稀釋的補體為1個個“恰定單位，恰定單位，0.08ml為為1個個“適用單位。補體結(jié)合適用單位。補體結(jié)合實驗用實驗用2個個“適用單位，那么適用單位，那么0.16ml 1:60稀釋補體相稀釋補體相當(dāng)于當(dāng)于2個個“適用單位。由于正式實驗時所參與的補體適用單位。由于正式實驗時所參與的補體量為量為0.2ml， 因此需按下公式算出所用補體的稀釋倍因此需按下公式算出所用補體的稀釋倍數(shù)。數(shù)。 0.082 ：600.2 ：X 600.2 X75 0.

12、082 即將豚鼠血清用即將豚鼠血清用pH 7.4巴比妥緩沖液作巴比妥緩沖液作1:75稀釋后，每稀釋后，每0.2ml中含中含2個適用單位的補體。個適用單位的補體。3、抗原和抗體的滴定：、抗原和抗體的滴定： 普通采用方陣滴定法，選擇抗原與抗體均呈強普通采用方陣滴定法，選擇抗原與抗體均呈強陽性反響的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價陽性反響的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價或單位。正式實驗時，抗原普通用或單位。正式實驗時，抗原普通用24個個單位，抗體采用單位，抗體采用4個單位。個單位。4、補體結(jié)合正式實驗、補體結(jié)合正式實驗 按照講義的表操作按照講義的表操作應(yīng)作抗原或血清對看管，應(yīng)作抗原或血清對看管，SRB

13、C、溶血素、溶血素對看管。對看管。四、結(jié)果察看四、結(jié)果察看1、管內(nèi)液體混濁呈淺紅色為不溶血，管內(nèi)、管內(nèi)液體混濁呈淺紅色為不溶血，管內(nèi)液體透明呈紅色為溶血。液體透明呈紅色為溶血。2、第、第2、3、4管為對看管均應(yīng)溶血，第管為對看管均應(yīng)溶血，第5管為綿羊紅細(xì)胞對照不應(yīng)溶血。凡第管為綿羊紅細(xì)胞對照不應(yīng)溶血。凡第1管管紅細(xì)胞發(fā)生溶血者為補體結(jié)合反響陰性，紅細(xì)胞發(fā)生溶血者為補體結(jié)合反響陰性，而不溶血者為陽性。而不溶血者為陽性。五、實驗報告五、實驗報告掌握實驗原理，記錄并分析實驗結(jié)果。掌握實驗原理，記錄并分析實驗結(jié)果。 溶血空斑構(gòu)成實驗溶血空斑構(gòu)成實驗Plaque Forming test，PFT小室液相

14、法小室液相法一、原理一、原理 小鼠溶血空斑構(gòu)成實驗：取用綿羊紅細(xì)胞小鼠溶血空斑構(gòu)成實驗：取用綿羊紅細(xì)胞SRBC免疫過的小鼠脾細(xì)胞懸液，與免疫過的小鼠脾細(xì)胞懸液，與SRBC和補體混合，灌入用玻片制備的透明小室中，和補體混合，灌入用玻片制備的透明小室中，孵育后脾細(xì)胞可產(chǎn)生抗孵育后脾細(xì)胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體與其周圍的抗體與其周圍的SRBC結(jié)合，在補體的作用下，即可溶解結(jié)合，在補體的作用下，即可溶解SRBC而構(gòu)成透明溶血區(qū)。而構(gòu)成透明溶血區(qū)。檢測實驗動物抗體生成細(xì)胞產(chǎn)生檢測實驗動物抗體生成細(xì)胞產(chǎn)生IgM的才干。的才干。二、器材與試劑二、器材與試劑1、撥片、雙面膠、撥片、雙面膠2、細(xì)胞培育板、細(xì)胞篩等、細(xì)胞培育板、細(xì)胞篩等3、SRBC、豚鼠血清補體、豚鼠血清補體 三、方法三、方法1、免疫小鼠、免疫小鼠2、制備脾細(xì)胞懸液、制備脾細(xì)胞懸液3、制備、制備10%SRBC4、補體制備、補體制備5、制備液相小室、制備液相小室6、正式實驗、正式實驗按講義混合小室液，用毛細(xì)滴管灌入小室，按講義混合小室液，用毛細(xì)滴管灌入小室，灌滿為止，用石蠟封邊，灌滿為止，用石蠟封邊