終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組二維電泳圖像與正常血清蛋白圖譜比較

1、終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組二維電泳圖像與正常血清蛋白圖譜比較研究王劍青1,戴勇2,鄧安國(guó)1,劉建軍3(11華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科,湖北武漢430022;21廣東省深圳市人民醫(yī)院31廣東省深圳市疾病預(yù)防控制中心【摘要】目的建立和優(yōu)化終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組研究的雙向電泳及相關(guān)技術(shù),并與正常血清蛋白圖譜比較。方法以固相pH梯度等電聚焦為第一向和垂直S DS2聚丙烯酰胺凝膠電泳為第二向,對(duì)終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)樣品制備、上樣量、I PG膠條、等電聚焦等進(jìn)行條件優(yōu)化。質(zhì)譜鑒定有差異表達(dá)的其中4個(gè)蛋白點(diǎn)。結(jié)果成功獲得終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組電泳圖譜,與正常者相比存在表達(dá)有明顯差異

2、的蛋白點(diǎn)。結(jié)論成功建立了終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組研究的雙向電泳技術(shù)平臺(tái)。關(guān)鍵詞腎功能衰竭;蛋白質(zhì)組;電泳,凝膠,雙向Est ablish m en t of two2d i m en si ona l gel electrophoresis techn i ca l pl a tfor m for the blood seru m proteo m e research i n pa ti en ts w ith end st age rena l d isea seWAN G J ian2qing,DA I Yong,D eng A n2guo,L I U J ian2jun.Depart

3、 m ent of Nephr ol ogy,Uni on Hos p ital,TongjiM edical College,Huazhong University of Science and Technol ogy,W uhan430022,China【Abstract】O bjecti veTo establish and op ti m ize the t w o2di m ensi onal gel electr ophoresis technical p latf or m f or the bl ood seru m p r o2 teome research in patie

4、nts with end stage renal disease(ESRD.M ethodsI m mobiline pH gradients is oelectric focusing was used as the first di m ensi onal gel electr ophoresis and the vertical S DS2P AGE was used as the second di m ensi onal gel electr ophoresis(22DE.The4dif2 ferentially exp ressed p r otein s pots were id

5、entified by mass s pectr ometry.ResultsSatisfact ory22DE map s of ESRD patients seru m p r otein were obtained and there were s ome differentially p r otein s pots bet w een the22DE map s of ES RD patients and nor mal contr ols.Conclusi on sThe22DE technol ogy for the seru m p r oteome of ESRD patie

6、nts is set up.【Key words】Kidney failure;Pr oteome;Electr ophoresis,gel,t ow di m ensi onal自從發(fā)現(xiàn)22MG 參與透析相關(guān)淀粉樣變后,提示蛋白質(zhì)可成為一類特殊的尿毒癥毒素1?，F(xiàn)已分離和鑒定出的蛋白質(zhì)毒素有數(shù)十種,但終末期腎病(ESRD患者癥狀及并發(fā)癥復(fù)雜,僅用數(shù)十種蛋白和其它一些中分子及小分子毒素并不能完全解釋。若能將ESRD 患者和正常人的血清蛋白質(zhì)譜比較,將為今后對(duì)那些異常表達(dá)的蛋白進(jìn)行分離、鑒定和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),最終判定是否為尿毒癥蛋白質(zhì)毒素提供一個(gè)早期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但血液蛋白質(zhì)成分復(fù)雜,含有多種鹽、脂質(zhì)等影

7、響蛋白質(zhì)分離的物質(zhì)2,因此建立一個(gè)優(yōu)化的血液蛋白質(zhì)組研究技術(shù)體系非常重要。為獲得準(zhǔn)確性和重復(fù)性高的ESRD患者差異性表達(dá)的血清蛋白質(zhì)點(diǎn),本研究對(duì)ESRD患者和正常人的血清蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳(2DE條件摸索,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案,最終獲得了滿意的蛋白質(zhì)電泳圖譜,并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALD I2T OF2T OF2MS成功鑒定了任意選取的4個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)。1材料與方法11一般資料ESRD組根據(jù)葉任高主編的第五版內(nèi)科學(xué)尿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)3,選擇4名病因?yàn)槁阅I小球腎炎的男性ESRD患者,年齡4160(5113±811歲,為2004年10月11月深圳市人民醫(yī)院腎內(nèi)科住院病人,

8、屬保守治療?；颊卟∏榉€(wěn)定,采血前一月內(nèi)無(wú)細(xì)菌感染征象、無(wú)心衰和糖尿病等病史。血壓控制在92140/7690mmHg(1mmHg=01133kPa,平均動(dòng)脈壓為(9516±814mmHg。肌酐630789mol/L,平均(698±90mol/L,尿量8001000m l/ d。對(duì)照組選4名該院門診男性健康體檢者。年6Bozcuk H,U slu G,Pestereli E,et al.Predict ors of distant metastasis at p resentati on in breast cancer:a study als o evaluating ass

9、 ociati ons a mong common bi ol ogical indicat ors.B reast Cancer Res Treat,2001,68(3: 239.7R i ou G,Mathieu MC,Barr ois M,et al.c-erbB-2(HER-2/neu gene a mp lificati on is a better indicat or of poor p r ognosis than p r otein over-exp ressi on in operable breast-cancer patients.I nt J Cancer,2001,

10、 95(4:266-270.8劉彤華主編.診斷病理學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社,1994,577-587.收稿日期:2004-03-0173中國(guó)醫(yī)師雜志2006年1月第8卷第1期齡4060(5218±716歲。血壓90132/6086mm 2Hg,平均動(dòng)脈壓為(8514±611mmHg 。肌酐5491(72±20mol/L,尿量15002000m l/d 。12材料主要試劑及儀器13c m I PG 膠條(pH 4-7L 、24c m I PG 膠條(pH 3-10L 、尿素、硫脲、CHAPS 、2D clean 2up kit 、Auru m T MSerum Pr

11、 otein M ini Kit 、等電聚焦電泳儀、SE600垂直電泳槽、Ettan DALT 垂直電泳系統(tǒng)均為Amersham B i ociences 公司產(chǎn)品;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸購(gòu)自BB I 公司;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。溶液成分樣品溶解液、I PG 溶脹液、平衡液、銀染溶液均參照郭堯君4著蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)配制。13方法血清蛋白質(zhì)樣品制備取8名受檢對(duì)象空腹靜脈血,室溫放置30m in,離心3000×g,15m in收集血清。取60l 血清用Aurum T MSeru m Pr otein M ini Kit 處理去除血清白蛋白和I gG 。再用2D clean 2

12、up kit 或丙酮純化,樣品裂解液溶解蛋白。Lowry 法定量。雙向電泳等電聚焦電泳主要按膠內(nèi)加樣方法進(jìn)行,并參照I PGphor 等電聚焦系統(tǒng)操作指南5,6。S DS 2聚丙烯酰胺凝膠電泳(S DS 2P AGE 分別在SE600垂直電泳槽(13c m 膠條和Ettan DAL II 垂直電泳槽(24c m 膠條中進(jìn)行。2DE 圖像采集與分析采用郭堯君4的銀染方法并作適當(dāng)改動(dòng)。染色的凝膠經(jīng)透射掃描用I m age Master 2D 510軟件分析,不同膠匹配點(diǎn)相對(duì)含量的比值>2或者<015認(rèn)為存在差異。差異蛋白質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索酶解后的混合物經(jīng)提取肽段和自然干燥后等進(jìn)行肽質(zhì)

13、量指紋圖譜和MALD I 2T OF 2T OF 2MS 分析,所獲得圖譜在I P I human數(shù)據(jù)庫(kù)總中搜索。2結(jié)果2124cm I PG 膠條(pH 3-10L 的血清蛋白質(zhì)圖譜對(duì)照組檢測(cè)到(504±49個(gè)蛋白點(diǎn),ESRD 組檢測(cè)到(569±47個(gè)蛋白點(diǎn),2組差異點(diǎn)的分布如圖2方框所示 。圖1 對(duì)照組圖2ESRD 組22條件優(yōu)化后的血清蛋白質(zhì)圖譜對(duì)照組檢測(cè)到蛋白點(diǎn)(287±38個(gè),ESRD 組檢測(cè)到(307±24個(gè)蛋白點(diǎn)。見(jiàn)圖3,圖 4圖3 對(duì)照組圖4ESRD 組23質(zhì)譜鑒定2組間匹配點(diǎn)相對(duì)含量表達(dá)上有差異的共54個(gè),任選其中4個(gè)差異點(diǎn)進(jìn)行MALD

14、 I 2T OF 2T OF 2MS 鑒定,鑒定出的蛋白名稱為KI A A1627p r otein 、transthyretin 、RNA binding motif p r otein 4、nuclear recep 2t or subfa m ily 3。3討論血清低豐度蛋白的分離常受到高豐度蛋白、脂質(zhì)、鹽類等影響,而ESRD 患者由于各系統(tǒng)代謝紊亂使得血液成分更復(fù)雜從而影響低豐度蛋白的分離和鑒定,因此建立一個(gè)專門針對(duì)ESRD 患者血清成分變化的方案才能應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)開展尿毒癥蛋白質(zhì)毒素的研究。本研究以ESRD 患者血清蛋白為樣品,對(duì)樣品制備、等電聚焦(I EF 上樣量、凝膠染色等進(jìn)行

15、比較和條件的優(yōu)化,獲得滿意的ESRD 患者血清蛋白2DE 圖譜。本研究首先用24c m (pH 3-10L 的膠條進(jìn)行I EF,發(fā)現(xiàn)血清蛋白廣泛分布于等電點(diǎn)(P I 3-10范圍,對(duì)照組檢測(cè)到(504±49個(gè)蛋白點(diǎn),平均匹配率為78132%;ESRD 組檢測(cè)到(569±47個(gè)蛋白點(diǎn),平均匹配率為82131%,經(jīng)I m age Master 2D 510凝膠軟件分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要分布在P I 415-615范圍,如圖2中方框所示處,為更清晰觀察和比較ESRD 患者差異性表達(dá)的蛋白分布情況,以下研究均采用13c m (pH 4-7L I PG 膠條。本研究根據(jù)ESRD 患者體

16、內(nèi)代謝變化對(duì)樣品采取了如下處理:ESRD 患者因代謝紊亂導(dǎo)致部分蛋白產(chǎn)生和清除異常,與正常者比較主要是低豐度蛋白,因此有效去除高豐度蛋白對(duì)本研究尤為重要6。Auru m T MSerum Pr otein M ini Kit 能特異吸附白蛋白和I gG,經(jīng)其處理后樣品圖譜中的低豐度蛋白分布區(qū)域顯示清晰,分辨率明顯提高。ESRD 患者有鹽等多種小分子物質(zhì)潴留在血中,樣品含的這些物質(zhì)將影響I EF,使電壓難以達(dá)到I EF 所需,最終影響2DE效果7。本研究選用丙酮沉淀和2D clean 2up kit 純化樣品,與處理前相比這兩種方法均能得到清晰的蛋白83Journal of Chinese Ph

17、ysician,January,2006,Vol 8,No1點(diǎn)。但丙酮處理會(huì)致血清P I6-7處蛋白丟失,影響該區(qū)域差異蛋白的比較,為確保差異表達(dá)的蛋白均能呈現(xiàn)出來(lái)本研究采用前者來(lái)處理樣品。傳統(tǒng)蛋白溶解液一般含有Tris,本研究發(fā)現(xiàn)含Tris的血清蛋白樣品在I EF時(shí)電壓常難達(dá)到8000伏,并出現(xiàn)大量水平紋。樣品蛋白含量測(cè)定的準(zhǔn)確性會(huì)直接影響I EF上樣量的確定和2DE圖譜蛋白點(diǎn)的多少,ESRD患者如果血清樣品蛋白上樣量太低,有可能影響低豐度表達(dá)的尿毒癥蛋白質(zhì)毒素比較,本研究采用的蛋白不同上樣量中,100g蛋白能得到最佳的圖譜效果,有差異表達(dá)的低豐度區(qū)域蛋白點(diǎn)顯示清晰,高豐度蛋白區(qū)域又不太明顯

18、。染色方法有多種,考馬斯亮藍(lán)染色雖特異性高,但上樣量大,對(duì)本研究不適用,經(jīng)不斷摸索改良了傳統(tǒng)的銀染方案,最終得到滿意的銀染電泳圖譜。為清晰觀察ESRD患者血清蛋白質(zhì)譜的分布范圍,本研究首先使用24c m pH3-10L膠條為第一向等電聚焦,第二向采用垂直S DS2P AGE,Ettan DAL II垂直電泳槽系統(tǒng)。經(jīng)軟件初步分析,發(fā)現(xiàn)ESRD患者和正常人表達(dá)有差異的蛋白主要分布在P I415-615范圍。故本研究最終采用13c m膠條進(jìn)行蛋白分離,獲得了理想分離效果。通過(guò)對(duì)以上幾種有可能影響血清蛋白質(zhì)2DE的各因素比較,本研究獲得了優(yōu)化的研究ESRD患者血清蛋白質(zhì)圖譜變化的方案,即:使用Aur

19、u m T M Serum Pr otein M ini Kit親和吸附去除血清中白蛋白和I gG、2D clean2up kit純化蛋白樣品、使用不含有Tris的蛋白溶解液、用13c m I PG膠條(pH4-7L進(jìn)行I EF、使用改良的銀染方案,圖3和圖4是根據(jù)此方案而分別得到的正常人和ESRD患者血清蛋白2DE銀染圖譜。在相同條件下,分別對(duì)2組樣品進(jìn)行3次2DE,圖譜經(jīng)軟件分析和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后顯示:正常者檢測(cè)到(287±38個(gè)蛋白點(diǎn),平均匹配率為84132%;ESRD患者檢測(cè)到(307±24個(gè)蛋白點(diǎn),平均匹配率為90155%,提示本研究采用的蛋白質(zhì)2DE方案有較好重現(xiàn)性。

20、血清蛋白質(zhì)P I和分子量分布范圍很廣,但與正常人相比有差異的ESRD患者蛋白點(diǎn)多數(shù)集中于P I415-615,表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)有54個(gè)。為明確建立的電泳方案和銀染方法與質(zhì)譜是否兼容,遂從54個(gè)有差異的點(diǎn)中隨機(jī)選取4個(gè)在不同批次膠上重復(fù)性好的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALD I2T OF2T OF2MS鑒定,鑒定出的蛋白為KI A A1627p r otein、transthyretin、RNA binding motif p r o2 tein4、nuclear recep t or subfa m ily3。通過(guò)對(duì)影響ESRD患者血液蛋白質(zhì)組2DE各種條件的比較,可認(rèn)為本研究目前建立的ESRD患

21、者血清蛋白2DE,能全面滿足研究ESRD患者血清中異常表達(dá)的蛋白質(zhì),為尿毒癥蛋白質(zhì)毒素的研究提供了一個(gè)早期實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。參考文獻(xiàn)1侯凡凡.對(duì)尿毒癥毒素的新認(rèn)識(shí).中華腎臟病雜志,2003,19(2:69 -70.2H ille J M,Freed AL,W atzig H.Possibilites t o i m p r ove aut omati on, s peed and p recisi on of p r oteome analysis:a comparisi on of t w o-di m en2 si onal electr ophoresis and alternative.Ele

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