端粒酶與前列腺癌及其生物學(xué)行為的關(guān)系

1、端粒酶與前列腺癌及其生物學(xué)行為的關(guān)系【摘要】目的探討端粒酶(TE)與前列腺癌(PCa)及其生物 學(xué)行為的關(guān)系。方法應(yīng)用端粒重復(fù)片段擴(kuò)增法(TRAP法)檢測39例PC a組織、15例前列腺增生(BPH)組織及10例正常前列腺(NP)組織中的TE活性，并比較TE活性水 平與PCa病理分化程度、臨床分期及轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系。結(jié)果PCa組織 中TE活性陽性率(89.7%)明顯高于BPH組織(6.7%)及NP組織(0.0%)；在PCa組織中，病理分 化程度低、晚期及合并淋巴或(和)血行轉(zhuǎn)移者的TE活性水平明顯高于病理分化程度高、早期 及未合并轉(zhuǎn)移者。結(jié)論P(yáng)Ca的發(fā)病與TE被激活有關(guān)，TE可能成為PCa 早期

2、診斷及鑒別診斷的一項(xiàng)新的腫瘤標(biāo)志物，并可能與PCa病理分化程度、臨床分期及轉(zhuǎn)移 情況等生物學(xué)行為相關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】前列腺腫瘤癌端粒酶 Telomerase activity in prostate cancer and its relationship to the biological malignant potentials of prostate cancerDENG Chunhua,ZHE NG Keli,CHEN Wei,et al.(Department of Urology,the First Affiliated Hospital,Sun Y at-sen University

3、of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the telomerase act ivity in prostate cancer and its relationpship to the biological malignant poten tials of prostate cancer.MethodsWith polymerase chain reaction bas ed telomeric repeat amplification protocol(TRAP)assay,te

4、lomerase activity was ex amined in 39 prostate cancer tissues,15 benign prostatic hyperplasia tissues and in none in 10 normal prostate tissues.ResultsTelomera se activity was detected in 35 of 39(89.7%)pros tate cancer tissues,in 1 of (6.3%)benign hyperplasia tissues and in none in 10 n ormal prost

5、ate tissues.Higher activity of telomerase was more frequently detecte d in poorly differentiated,advanced prostate cancer.Prostate cacer witn lymph no des and bone metastasis often expressed a higher level of telomerase activity th an theose without metastasis.ConclusionsDetermination of the telomer

6、ase activity in prostate cancer tissue might be a useful tool for detecting prostate cancer and for evaluating the bioloigical malignant potential s of prostate cancer.【Key words】Prostatic neoplasmsCarcinomaTel omerase研究表明，端粒酶(TE)活性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)1。Sommerfild等2于1996年首先報(bào)道前列腺癌(PCa)組織中可檢出TE活性。我們應(yīng)用端粒重復(fù)片段擴(kuò)增

7、法(TRAP法)研究國人PCa組織、前列腺增生(BPH)組織及正常前列腺(NP)組織的TE活性，探討TE與PCa及其生物學(xué)行為的關(guān)系。材料與方法一、標(biāo)本來源39例PCa組織均為經(jīng)直腸前列腺B超引導(dǎo)下穿刺活檢標(biāo)本。年齡5289歲，平均72歲。按Jewett-whitmore-prout方法進(jìn)行臨床分期，WHO方法進(jìn)行病理分級(jí)3。B期4例，C期14例，D期21例；未分化、低分化、中分化及高分化腺癌分別為2、14、10及13例。根據(jù)B超、CT或MRI及同位素骨掃描檢查結(jié)果，合并淋巴或(和)血行轉(zhuǎn)移者21例，無轉(zhuǎn)移者18例。15例BPH組織來源于經(jīng)恥骨上前列腺摘除手術(shù)的標(biāo)本。年齡5679歲，平均68歲

8、，經(jīng)病理學(xué)證實(shí)均為良性前列腺增生組織。10例NP組織取自意外死亡尸體，年齡2241歲，平均28歲。上述標(biāo)本獲取后，立即取液氮中速凍，然后置于-80冰箱中保存。二、TRAP法檢測TE活性1.組織提取液的制備：取上述組織，進(jìn)行液氮研磨，然后加入冷凍洗脫緩沖液離心，沉淀物用裂解緩沖液重新懸浮、孵育裂解，離心后的上清液為提取液，放于-80低溫冰箱中保存待用。每例提取液經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，以1mg/ml為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)濃度。2.TE活性測定用TRAP-eze(TM)kit端粒酶活性試劑盒(Gene公司)進(jìn)行檢測。每例標(biāo)本檢測體積為50l反應(yīng)液，其中包含2l提取液、74kBq(-32P)dCTP(杜邦公

9、司)和2UTaqDNA多聚酶(Promega公司)；按9430s，5030s，7290s進(jìn)行32周PCR循環(huán)，產(chǎn)物在15%的非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳、分離，電泳后凝膠與X線膠片置于-80低溫冰箱中作放射自顯影24h，膠片出現(xiàn)6bp或6bp整數(shù)倍為間隔的梯形條帶為陽性結(jié)果。為了對(duì)端粒酶的表達(dá)活性進(jìn)行半定量分析，實(shí)驗(yàn)參照Kamata等4方法將原端粒酶提取液分別稀釋10倍和100倍，再用同樣方法分別進(jìn)行端粒酶表達(dá)活性的檢測。將原液中端粒酶表達(dá)活性陰性者定為-，稀釋10倍后轉(zhuǎn)為陰性為+，稀釋100倍后轉(zhuǎn)為陰性為+，稀釋100倍后仍為陽性者為+。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用2檢驗(yàn)及Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

10、結(jié)果一、PCa、BPH及NP組織中TE活性陽性率39例PCa組織中檢出TE活性35例(89.7%)，而15例BPH組織中僅1例(6.7%)測得TE活性，10例NP組織中均未測得TE活性。PCa組織中TE活性陽性率顯者高于BPH組織及NP組織，P0.01(1)。1前列腺癌組織中端粒酶活性表達(dá)H.Hela細(xì)胞株為陽性對(duì)照；L.裂解緩沖液為陰性對(duì)照；1.正常前列腺組織端粒酶活性呈陰性；4.前列腺增生組織端粒酶活性呈陰性；2、3、5前列腺癌組織端粒酶活性呈陽性二、TE活性與PCa病理分級(jí)及臨床分期的關(guān)系39例PCa組織中，根據(jù)其病理分化程度分為低(未)分化、中分化、高分化三組(因未分化PCa僅2例，故

11、合并至低分化組)，各組間的TE活性水平差異有顯著性(P0.01)，低分化與中、高分化組織相比差異有顯著性和非常顯著性(P0.05，P0.01)；中分化與高分化組之間差異有顯著性(P0.05)。根據(jù)PCa臨床分期將其分為B、C、D期，各組間的TE活性水平差異有顯著性(P0.05)，其中D期與B、C期相比差異有非常顯著性(P0.05，表1)。 表1端粒酶(TE)活性與PCa病理分級(jí)、臨床分期及轉(zhuǎn)移的關(guān)系例數(shù)TE活性+-病理分級(jí)低分化1611500中分化102161高分化131363臨床分期B41120C144253D219651轉(zhuǎn)移有2110632無182382 三、PCa組織中TE活性與腫瘤轉(zhuǎn)移

12、的關(guān)系39例PCa組織，21例合并淋巴或(和)血行轉(zhuǎn)移者的TE活性水平顯著高于18例未合并轉(zhuǎn)移者(P0.05，表1)。 討論TE是一種包含RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，與一般蛋白酶不同，它是一種核糖核蛋白復(fù)合體，需在RNA和蛋白質(zhì)同時(shí)存在才具有活性1，2。在激活狀態(tài)下，TE能發(fā)揮逆轉(zhuǎn)錄酶活性，特異地延長染色體末端DNA的重復(fù)序列，從而抵銷或延緩端粒在正常情況下隨細(xì)胞分裂的不斷縮短。因此，TE被認(rèn)為很可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起極為重要的作用1，5。人類TE活性首次由Morin6于1989年自Hela細(xì)胞系中分離出來。其后，大量的研究表明幾乎所有的永生細(xì)胞和絕大部分的惡性腫瘤組織均有明顯的TE活性，而正

13、常人體細(xì)胞、部分良性腫瘤組織和非永生細(xì)胞系中則無或僅有極低的TE活性1，6。1994年Kim等7建立了以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的TE活性檢測方法-端粒重復(fù)片段擴(kuò)增法(TRAP法)，由于TRAP法靈敏度極高，能檢測到微量組織(如穿刺活檢標(biāo)本)的TE活性，使TE與人類腫瘤關(guān)系研究得到廣泛開展。PCa與高齡、基因不穩(wěn)定(腫瘤基因及腫瘤抑制基因突變)有密切關(guān)系2；PCa細(xì)胞能無限制地生長、分化，屬于永生細(xì)胞；這些特征都可能與TE被激活有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PCa組織中具有TE活性2。Lin等8進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PCa組織中的TE活性與PCa病理分化程度、臨床分期及轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)。但Zhang等9的研究則認(rèn)為TE活性與P

14、Ca患者血清前列腺特異抗原(PSA)水平、Gleason評(píng)分無相關(guān)關(guān)系。因此，有關(guān)PCa組織中TE活性與其生物學(xué)行為的關(guān)系尚未完全闡明。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)89.7%的PCa組織存在TE活性，而BPH及NP組織的TE活性檢出率分別為6.7%和0.0%，PCa組織中的TE活性明顯高于BPH及NP組織，與文獻(xiàn)報(bào)告吻合，表明國人PCa發(fā)病也可能與TE被激活有關(guān)。應(yīng)用高靈敏的TRAP法檢測TE活性有助于PCa的早期診斷及鑒別診斷；并可能有助于PCa合并淋巴或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的早期診斷。提示TE可能成為PCa早期診斷及鑒別診斷的一項(xiàng)新的腫瘤標(biāo)志物。在分析TE活性與PCa生物學(xué)行為關(guān)系時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)不同病理分化程度及不

15、同臨床分期的PCa組織中的TE活性水平存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即分化不良的PCa組織的TE活性水平明顯高于分化良好者，D期PCa組織的TE活性水平B、C期。我們還發(fā)現(xiàn)有淋巴或(和)血行轉(zhuǎn)移的PCa患者其TE活性水平顯著高于無轉(zhuǎn)移者，與Lin等8的報(bào)告相似。表明PCa組織中的TE活性與浸潤性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，TE活性表達(dá)高的PCa具有更大的惡性潛能，即PCa組織中的TE活性可能與其生物學(xué)行為有關(guān)。有人發(fā)現(xiàn)PCa轉(zhuǎn)移灶(淋巴結(jié)或骨轉(zhuǎn)移灶)的TE活性水平呈現(xiàn)異常高水平8。關(guān)于TE活性與PCa治療效果、預(yù)期生存時(shí)間等的關(guān)系，有待進(jìn)一步隨訪。對(duì)TE活性陽性的BPH，在施行前列腺切除術(shù)后，有必

16、要進(jìn)一步嚴(yán)密隨訪。本課題受衛(wèi)生部默沙東科學(xué)基金資助(97-007)作者單位：鄧春華（510080 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科）鄭克立（510080 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科）陳煒（510080 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科）丘少鵬（510080 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科）曾金云（510080 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科）梅驊（510080 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科）陳巧倫（510080 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所）陳小君（510080 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所）參考文獻(xiàn)1，De Lange

17、 T.Activation of telomerase in a human tumor.Proc Natl Acad Sci USA,1994,912882-2889.2，Sommerfild HJ,Meeker AK,Piatyszek,et al.Telomerase activity:a prevalent mar ker of malignant human prostate tissue.Cancer Res,1996,56218-222.3，孔祥田,郭應(yīng)祿.前列腺癌的病理診斷.見:郭應(yīng)祿主編.前列腺增生及前列腺癌.第1版. 北京:人民衛(wèi)生出版社.1998,194-202.4，Ka

18、mata S,Kageyama Y,Yonese J,et al.Significant telomere reduction in human superficial transitional cell carcinoma.Br J Urol,1996,78704-708.5，Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase in human cancer.Eur J Cancer，19 97,33787-792.6，Morin GB.The human telomere teminal transferase enzyme is a ribonucleo-pro tein that synthesizes TTAGGG repeats.Cell,1989,59521-525.7，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomeras e activity with immortal cells and cancer.Science,1994,2662011-2014.8，Lin