微生物分子生態(tài)報(bào)告

1、 分子生態(tài)學(xué)是應(yīng)用分子生物學(xué)的原理和方法來(lái)研究生命系統(tǒng)與環(huán)境系統(tǒng)相互作用的生態(tài)機(jī)理及其分子機(jī)制的科學(xué)。它是生態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相互滲透的形成的一門(mén)新興交叉學(xué)科，其研究?jī)?nèi)容包括種群在分子水平的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，生物器官變異的分子機(jī)制，生物體內(nèi)有機(jī)大分子對(duì)環(huán)境因子變化的響應(yīng)，生物大分子結(jié)構(gòu)、功能演變與環(huán)境長(zhǎng)期變化的關(guān)系以及其他生命層次生態(tài)現(xiàn)象的分子機(jī)理等。 微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是微生物生態(tài)學(xué)微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是微生物生態(tài)學(xué) 研究的熱點(diǎn)內(nèi)容研究的熱點(diǎn)內(nèi)容p群落結(jié)構(gòu)決定了生態(tài)功能的特性和強(qiáng)弱。p群落結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)生態(tài)功能的重要因素。p群落結(jié)構(gòu)變化是標(biāo)記環(huán)境變化的重要方面。通過(guò)對(duì)環(huán)境微生物

2、群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行解析并研究其動(dòng)態(tài)變化，可以為調(diào)節(jié)群落功能和發(fā)現(xiàn)新的重要微生物功能類群提供可靠的依據(jù)。 20世紀(jì)70年代以前：傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，依靠形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征、生理生化特性的比較進(jìn)行分類鑒定和計(jì)數(shù)，認(rèn)識(shí)是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究方法：微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究方法： 在70和80年代：對(duì)微生物化學(xué)成分的分析，建立了一些微生物分類和定量的方法（生物標(biāo)記物方法），對(duì)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的認(rèn)識(shí)進(jìn)入到較客觀的層次上。在80和90年代：現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以DNA為目標(biāo)物，通過(guò)rRNA基因測(cè)序技術(shù)和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺傳

3、的多樣性，并給出了關(guān)于群落結(jié)構(gòu)的直觀信息?？梢詸z測(cè)環(huán)境中的活細(xì)胞，并且對(duì)微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展起了很重要的作用。采用配比簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少 （不到1 % ）。Amann 等人報(bào)道在自然環(huán)境樣品中可培養(yǎng)的微生物占總的微生物數(shù)量的比例范圍從0.001%（海水）到0.3%（土壤）。 不能全面地反映微生物區(qū)系組成狀況，煩瑣、耗時(shí)。1、傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法、傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 營(yíng)養(yǎng)限制營(yíng)養(yǎng)限制 失去生態(tài)位失去生態(tài)位 微生物不可培養(yǎng)的原因微生物不可培養(yǎng)的原因2、群落水平生理學(xué)指紋方法、群落水平生

4、理學(xué)指紋方法(CLPP)微生物所含的酶與其豐度或活性是密切相關(guān)的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質(zhì)，則這種酶-底物可作為此群落的生物標(biāo)記分子之一。由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理學(xué)指紋方法(CLPP)，通過(guò)檢測(cè)微生物樣品對(duì)底物利用模式來(lái)反映種群組成的酶活性的分析方法。具體而言，CLPP就是通過(guò)檢測(cè)微生物樣品對(duì)多種不同的單一碳源的利用能力，來(lái)確定哪些基質(zhì)可以作為能源，從而產(chǎn)生對(duì)基質(zhì)利用的生理代謝指紋。 生物標(biāo)記物通常是微生物細(xì)胞的生化組成成分，其總量通常與相應(yīng)生物量呈正相關(guān)。 特定的標(biāo)記物標(biāo)志著特定的微生物，一些生物標(biāo)記物的組成模式(種類、數(shù)量和相對(duì)

5、比例)可作為指紋估價(jià)微生物群落結(jié)構(gòu)。 首先使用一種合適的提取劑直接把生物標(biāo)記物從環(huán)境中提取出來(lái)，然后對(duì)提取物進(jìn)行純化，后用合適的儀器加以定量測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)：不需要把微生物的細(xì)胞從環(huán)境樣中分離，能克服由于培養(yǎng)而導(dǎo)致的微生物種群變化，具有一定的客觀性。醌指紋法醌指紋法(Quinones Profiling) 磷脂是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的主要成分，約占細(xì)胞干重的5%。在細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因此它只在活細(xì)胞中存在，十分適合于微生物群落的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。磷脂脂肪酸（磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪）、甲基脂肪酸酯（酸酯（Fatty a

6、cid methyl ester, FAME）譜圖分析）譜圖分析 脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。 甲基脂肪酸酯是細(xì)胞膜磷脂水解產(chǎn)物，氣相色譜分析系統(tǒng)分析出全細(xì)胞的FAME譜圖。 磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來(lái)，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。 PLFA方法適合跟蹤研究微生物群落的動(dòng)態(tài)方法適合跟蹤研究微生物群落的動(dòng)態(tài)變化變化,能夠快速有效的從環(huán)境樣品種提取大部分脂能夠快速有效的從環(huán)境樣品種提取大部分脂肪酸肪酸,但是也有其局限性。但是也有其局限性。 第一第一,他不能從種的水品上鑒定微生物他不能從種的水品上鑒定微生物,只能只能鑒定到屬鑒定到

7、屬; 第二第二,這種方法強(qiáng)烈的依賴于標(biāo)記脂肪酸這種方法強(qiáng)烈的依賴于標(biāo)記脂肪酸,標(biāo)標(biāo)記脂肪酸變化導(dǎo)致錯(cuò)誤的群落變化估計(jì)記脂肪酸變化導(dǎo)致錯(cuò)誤的群落變化估計(jì),因此操作因此操作過(guò)程需要十分謹(jǐn)慎過(guò)程需要十分謹(jǐn)慎,防止人為因素的干擾。防止人為因素的干擾。 第三第三,細(xì)菌和真菌在不同的生長(zhǎng)時(shí)期以及環(huán)境細(xì)菌和真菌在不同的生長(zhǎng)時(shí)期以及環(huán)境壓力下的脂肪酸含量有所變化壓力下的脂肪酸含量有所變化,給監(jiān)測(cè)帶來(lái)困難。給監(jiān)測(cè)帶來(lái)困難。 另外，不同微生物種屬之間脂肪酸組成有重另外，不同微生物種屬之間脂肪酸組成有重疊，外來(lái)生物污染也限制了脂肪酸譜圖法對(duì)種群疊，外來(lái)生物污染也限制了脂肪酸譜圖法對(duì)種群結(jié)構(gòu)解析的可靠性。結(jié)構(gòu)解析的可

8、靠性。 在微生物群落中，各細(xì)菌數(shù)量占1-10%時(shí)，其特征性ERIC-PCR主條帶就可以在指紋圖中表現(xiàn)出來(lái)。ERIC-PCR指紋圖中，每一條帶可以是來(lái)自若干種不同微生物的基因組DNA片段，條帶的數(shù)目反映微生物類群的多少，條帶的亮度反映該類群微生物種群數(shù)量的高低。 分析不同環(huán)境樣品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指紋圖譜的差異，就可比較不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的差異，或者同一個(gè)群落在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化。5. 以以PCR為基礎(chǔ)的為基礎(chǔ)的rRNA及及rDNA的分析方法的分析方法 用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析的基因組DNA的序列包括：核糖體操縱子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重復(fù)序列和隨機(jī)

9、基因組序列等。 最常用的標(biāo)記序列是核糖體操縱子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在細(xì)胞中相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類的一個(gè)重要指標(biāo)。 變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世紀(jì)80 年代初期發(fā)明的，起初主要用來(lái)檢測(cè)DNA 片段中的點(diǎn)突變。 Muyzer 等人在1993 年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究 。后來(lái)又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。 此后十年間，該技術(shù)被廣

10、泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一 。 雙鏈DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長(zhǎng)度的DNA 片段能夠被區(qū)分開(kāi)，但同樣長(zhǎng)度的DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，不能被區(qū)分。 DGGE/TGGE 技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA 片段區(qū)分開(kāi)來(lái)。 一個(gè)特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(melting domain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。 一個(gè)幾百

11、個(gè)堿基對(duì)的DNA 片段一般有幾個(gè)解鏈區(qū)域，每個(gè)解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對(duì)組成。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加各區(qū)域依次發(fā)生解鏈。 顯示的是一個(gè)234bp 長(zhǎng)的DNA 片段的解鏈區(qū)域，橫坐標(biāo)是該DNA 片段的序列，依次從第一個(gè)堿基到第234 個(gè)堿基；縱坐標(biāo)是解鏈溫度。該DNA 片段共有3 個(gè)解鏈區(qū)域。 MD1 是解鏈溫度最低的一個(gè)解鏈區(qū)域，MD3 是溫度最高的一個(gè)解鏈區(qū)域。 不同的雙鏈DNA 片段因?yàn)槠湫蛄薪M成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。 當(dāng)它們進(jìn)行DGGE時(shí)，一開(kāi)始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時(shí)DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠

12、中一樣。 一旦DNA 片段遷移到一定位置，其變性劑濃度使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，部分解鏈的DNA 片段在膠中的遷移速率會(huì)急劇降低。因此，不同的DNA 片段會(huì)在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開(kāi)來(lái)。 然而，當(dāng)變性劑濃度達(dá)到DNA 片段最高的解鏈區(qū)域溫度時(shí)，DNA 片段會(huì)完全解鏈，此時(shí)它們又能在膠中繼續(xù)遷移，這些片段就不能被區(qū)分開(kāi)來(lái)。 在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般30-50 個(gè)堿基對(duì)）可以解決這個(gè)問(wèn)題。 含有GC 夾子的DNA 片段解鏈溫度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。 當(dāng)加了GC 夾子后

13、，DNA 片段中每個(gè)堿基處的序列差異都能被區(qū)分開(kāi)。 當(dāng)用DGGE/TGGE 技術(shù)來(lái)研究微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，要結(jié)合PCR（polymerase chain reaction）擴(kuò)增技術(shù)，用PCR 擴(kuò)增的16S rDNA 產(chǎn)物來(lái)反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成。 通常根據(jù)16S rRNA 基因中比較保守的堿基序列設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物的5-端含有一段GC 夾子，用來(lái)擴(kuò)增微生物群落基因組總DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物用于DGGE/TGGE 分析。 由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片斷，所以一般選擇擴(kuò)增16S rRNA基因的V3區(qū)或V6-V8區(qū)。40%60%DenaturantCABCBADen

14、aturing Gradient Gel ElectrophoresisPCR11f1512r1392r968fgc16S rDNA 環(huán)境樣品的核酸提取在土壤微生物生態(tài)中非常重要。環(huán)境樣品的核酸提取在土壤微生物生態(tài)中非常重要。最初采用的方法主要是劇烈的最初采用的方法主要是劇烈的機(jī)械打碎以及超聲波破碎機(jī)械打碎以及超聲波破碎細(xì)胞細(xì)胞。但是這種方法得到的。但是這種方法得到的DNA片斷一般在片斷一般在5K10K大大小小,不適合作微生物的群落分析。微生物細(xì)胞與環(huán)境中不適合作微生物的群落分析。微生物細(xì)胞與環(huán)境中的土壤顆粒、粘土以及有機(jī)物接合緊密的土壤顆粒、粘土以及有機(jī)物接合緊密,這對(duì)高效率提這對(duì)高效率提取

15、核酸造成了很大的困難。同時(shí)取核酸造成了很大的困難。同時(shí),腐植酸腐植酸對(duì)對(duì)DNA的檢測(cè)的檢測(cè)和定量也有很大的影響和定量也有很大的影響,主要表現(xiàn)在抑制主要表現(xiàn)在抑制DNA高溫聚合高溫聚合酶的活性酶的活性,干擾限制酶的位點(diǎn)識(shí)別干擾限制酶的位點(diǎn)識(shí)別,降低轉(zhuǎn)化效率以及降低轉(zhuǎn)化效率以及DNA雜交的特異性。雜交的特異性。Jizhong Zhou等人研究了各種提等人研究了各種提取方法取方法,他們將土壤樣品他們將土壤樣品DNA提取分為細(xì)胞裂解粗提提取分為細(xì)胞裂解粗提DNA和純化兩個(gè)步驟和純化兩個(gè)步驟,并將幾種方法進(jìn)行比較并將幾種方法進(jìn)行比較,建立了一建立了一種對(duì)大多數(shù)土壤樣品簡(jiǎn)單、快速、高效的基于種對(duì)大多數(shù)土壤

16、樣品簡(jiǎn)單、快速、高效的基于SDS的提的提取方法。很多實(shí)驗(yàn)表明取方法。很多實(shí)驗(yàn)表明,現(xiàn)在能夠從土壤樣品中提取出現(xiàn)在能夠從土壤樣品中提取出超過(guò)超過(guò)90%的的rDNA 基于基于PCR技術(shù)的方法也存在著不足技術(shù)的方法也存在著不足: 環(huán)境樣品在提取核酸前的厭氧或室溫存放不可避環(huán)境樣品在提取核酸前的厭氧或室溫存放不可避免的導(dǎo)致其樣品中微生物的變化免的導(dǎo)致其樣品中微生物的變化,冷凍可以減緩變化冷凍可以減緩變化,但是不能存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)但是不能存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng),真菌在真菌在04攝氏度仍可以觀攝氏度仍可以觀察到明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象。察到明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象。 每次提取每次提取DNA的效率不同的效率不同,造成結(jié)果重復(fù)性差。造成結(jié)果重

17、復(fù)性差。 某些原核生物細(xì)胞比其他細(xì)胞容易裂解某些原核生物細(xì)胞比其他細(xì)胞容易裂解,引起裂解引起裂解程度不均一程度不均一,使得不易裂解的細(xì)胞的豐度估計(jì)過(guò)低。使得不易裂解的細(xì)胞的豐度估計(jì)過(guò)低。 引物對(duì)不同樣品的擴(kuò)增效率不同引物對(duì)不同樣品的擴(kuò)增效率不同,引起豐度估計(jì)偏引起豐度估計(jì)偏差。差。 理論上理論上,對(duì)真核生物的分析應(yīng)該象原核生物一樣進(jìn)對(duì)真核生物的分析應(yīng)該象原核生物一樣進(jìn)行行,但是由于真核生物的核糖體的編碼基因以及調(diào)節(jié)但是由于真核生物的核糖體的編碼基因以及調(diào)節(jié)機(jī)制比較復(fù)雜機(jī)制比較復(fù)雜,對(duì)其的研究還不夠透徹對(duì)其的研究還不夠透徹,現(xiàn)今應(yīng)用在真現(xiàn)今應(yīng)用在真核微生物生態(tài)學(xué)的分析上還是比較少。核微生物生態(tài)學(xué)

18、的分析上還是比較少。l 隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性方法(RAPD)l 限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)l 變性梯度凝膠電泳與溫度梯度凝膠電泳技術(shù)l 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)l 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 PCR技術(shù)(SSCD) DNA 限制性內(nèi)切酶具有識(shí)別特定的DNA 序列并在特定的部位切斷DNA 雙鏈的活性功能，DNA 分子由于突變（核苷酸的置換、插入或缺失）改變（或形成）了限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，使DNA 限制性內(nèi)切酶不能（或可以）將靶DNA 片段切斷，電泳檢測(cè)時(shí)，存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列者原DNA 片段變成短片段；不存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列者原DNA 片段長(zhǎng)度將不發(fā)生變化。

19、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD） 亦稱隨機(jī)引物PCR（Arbitrarily Primed PCR, AP-PCR），是Willam和Welsh于1990年建立的基因分型方法。該方法是建立在PCR基礎(chǔ)上的新的檢測(cè)基因組多態(tài)性的基因分型技術(shù)，它利用采用隨機(jī)選擇的單條或多條8-12mer引物經(jīng)PCR擴(kuò)增基因組DNA片段，然后通過(guò)凝膠電泳分析其DNA指紋圖譜，其結(jié)果既表現(xiàn)種系發(fā)育過(guò)程的相互聯(lián)系，也反映了不同克隆之間存在的差異，從而可鑒定不同菌株在基因水平上的差異。 雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于分子

20、大小和電荷。不同長(zhǎng)度的DNA片段能夠被區(qū)分開(kāi)，但同樣長(zhǎng)度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。DGGE/TGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA片段區(qū)分開(kāi)來(lái)。 AFLP 是 RFLP 與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組 DNA 產(chǎn)生不同大小的 DNA 片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板 DNA，然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，最后在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加 13個(gè)選擇性核苷酸作引物對(duì)模板 DNA 基因再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分

21、離檢測(cè)獲得的DNA擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同檢測(cè)出多態(tài)性。 單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來(lái)維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或 少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開(kāi).稱該方法為單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。在隨后的研究中，科學(xué)家又 將SSCP用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，從而建立了PCR-

22、SSCP技術(shù)，進(jìn)一步提高了 檢測(cè)突變方法的簡(jiǎn)便性和靈敏性. 基本過(guò)程是基本過(guò)程是: PCR擴(kuò)增靶DNA; 將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，而后快速?gòu)?fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子; 將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳; 最后通過(guò)放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果. 若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對(duì)照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變. 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)的擴(kuò)展,它

23、集RFLP、PCR和核酸電泳技術(shù)于一體9210。該方法依據(jù)微生物的比較基因組學(xué)信息,選取一段具有系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記特征的DNA序列為目的分析序列,并據(jù)此設(shè)計(jì)出理想引物,用熒光物質(zhì)標(biāo)記出1個(gè)或2個(gè)引物的5端(2個(gè)引物同時(shí)標(biāo)記時(shí),要用不同的熒光物質(zhì)標(biāo)記)。常用的熒光物質(zhì)有四氯熒光素TET (52tetrachloro fluorescein) 11、綠色的六氯熒光素HEX (52hexachloro 2fluorescein)9以及藍(lán)色的六羧基熒光素62FAM 等。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用四堿基限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化,熒光標(biāo)記末端片段可被測(cè)序儀識(shí)別,得到不同的末端片段峰,每一個(gè)峰就可至少代表一種類型的微生物,

24、通常用系統(tǒng)分類操作單元(OTU)來(lái)表示。故根據(jù)片段峰的大小和數(shù)量可以檢測(cè)和分析環(huán)境樣品中微生物的末端限制性片段圖譜,進(jìn)而可分析出微生物群體的組成和動(dòng)態(tài)變化等生態(tài)信息 高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencin）高通量測(cè)序技術(shù)堪稱測(cè)序技術(shù)發(fā)展歷程的一個(gè)里程碑，該技術(shù)可以對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè) DNA 分子進(jìn)行同時(shí)測(cè)序。這使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，因此也稱其為深度測(cè)序 ( deep sequencing) 或 下一代測(cè)序技術(shù)( next generation sequencing， NGS)2005 年，454 Life Sciences 公司( 現(xiàn)已被

25、 Roche 公司收購(gòu)) 首先推出了革命性的基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)， 開(kāi)創(chuàng)了第二代測(cè)序技術(shù)的先河。該技術(shù)的原理是酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng): 首先將 PCR 擴(kuò)增的單鏈 DNA 與引物雜交， 并與 DNA 聚合酶、 ATP 硫酸化酶、 熒光素酶、 三磷酸腺苷雙磷酸酶、 底物熒光素酶和 5-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中只加入一種 dNTP，若該 dNTP 與模板配對(duì)， 聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸。焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為 ATP， ATP 就會(huì)促使氧合熒光素的合成并釋放可見(jiàn)光。CCD 檢測(cè)后通過(guò)軟件轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值， 峰值與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比 。 高通量測(cè)序技術(shù)有三大優(yōu)點(diǎn)是傳統(tǒng) Sanger測(cè)序法所不具備的第一，它利用芯片進(jìn)行測(cè)序， 可以在數(shù)百萬(wàn)個(gè)點(diǎn)上同時(shí)閱讀測(cè)序。第二，高通量測(cè)序技術(shù)有完美的定量功能， 這是因?yàn)闃悠分心撤N DNA 被測(cè)序的次數(shù)反映了樣品中這種 DNA的豐度。第三，成本低廉。Mardis E R Next-generation DNA sequencing methods Annu Rev Genomics Hum Genet， 2008， 9: 387-402Sultan M， Schulz M H， Richard H， et al A global view of ge