三種基因編輯工具的比較

1、比較三種基因編輯技術(shù)一、基因編輯的概念基因編輯是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上， 在這位點(diǎn)上剪斷靶標(biāo) DNA 片段并插入新的基因片段。此過(guò)程既模擬了基因的自然突變， 又修改并編輯了原有的基因組， 真正達(dá)成了“編輯基因” 。目前主要有 3 種基因編輯技術(shù)， 分別為： a)人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技術(shù)；b) 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技術(shù)；c) RNA 引導(dǎo)的 CRISPR- C

2、as 核酸酶技術(shù)(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas )。二、 三種基因編輯技術(shù)的介紹 1.ZFN基因編輯技術(shù)ZFN 技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實(shí)現(xiàn)是基于具有獨(dú)特的DNA序列識(shí)別的鋅指蛋白發(fā)展起來(lái)的。ZFN 由特異性識(shí)別序列的鋅指蛋白(ZFP)和 Fok核酸內(nèi)切酶組成。其中，由 ZFP 構(gòu)成的 DNA 識(shí)別域能識(shí)別特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由Fok構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA 斷

3、裂(DSB)。于是， 細(xì)胞可以通過(guò)同源重組(HR)修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來(lái)修復(fù) DNA。HR 修復(fù)有可能會(huì)對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而 NHEJ 修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。 2.TALEN基因編輯技術(shù) TALE（Transcription activator -like effectors）:一種源于植物致病菌Xanthomonas sp.的靶向基因操作技術(shù)。 TALENs 包含兩個(gè) TALEN 蛋白, 每個(gè) TALEN 都是由 TALE array 與 Fok融合而成. 其中一個(gè) TALEN 靶向正義鏈上靶標(biāo)

4、位點(diǎn), 另一個(gè)則靶向反義鏈上的靶標(biāo)位點(diǎn). 然后 Fok形成二聚體, 在靶向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細(xì)胞啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 針對(duì)不同的TALEN 骨架, 其最適宜的spacer長(zhǎng)度不同, 其長(zhǎng)度范圍一般為1220 bp. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, TALENs在靶向DNA時(shí), 第一個(gè)堿基為 T 時(shí)其結(jié)合效果更佳。3. CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)由 Cas9 核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成. 轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與 Cas9 蛋白形成復(fù)合體, 指導(dǎo) Cas9 核酸內(nèi)切酶識(shí)別特定靶標(biāo)位點(diǎn), 在

5、 PAM 序列上游處切割 DNA 造成雙鏈 DNA 斷裂, 并啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 從不同菌種中分離的 CRISPR/Cas 系統(tǒng), 其 CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長(zhǎng)度不同, PAM 序列也可能不同。最新報(bào)道，CRISPR-C2c2系統(tǒng)能夠根據(jù)靶向序列特異地編輯單鏈RNA。三、 三種編輯技術(shù)的比較1.共同點(diǎn)結(jié)構(gòu)的相似性：無(wú)論是ZFN、TALEN還是CRISPR /Cas9，都是由DNA識(shí)別域和核酸內(nèi)切酶兩部分組成。其中ZFN技術(shù)具有鋅指結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別靶點(diǎn)DNA，而TALEN的DNA識(shí)別區(qū)域是重復(fù)可變雙殘基的重復(fù)，DNA剪切區(qū)域都是一種名為Fokl的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)

6、域。CRISPR的DNA識(shí)別區(qū)域是crRNA或向?qū)NA，Cas9蛋白負(fù)責(zé)DNA的剪切。當(dāng)DNA結(jié)合域識(shí)別靶點(diǎn)DNA序列后，核酸內(nèi)切酶或Cas9蛋白將DNA剪切，靶DNA雙鏈斷裂，再啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)基因敲除、插入等。作用過(guò)程的相似性：通過(guò)識(shí)別模塊對(duì)特異性的位點(diǎn)識(shí)別并結(jié)合，然后在相關(guān)核酸內(nèi)切酶的作用下完成特定位點(diǎn)的剪切，從而借助于細(xì)胞內(nèi)固有的HDR（同源定向修復(fù)）或NHEJ（非同源末端連接）途徑修復(fù)過(guò)程完成特定序列的插入、刪除及基因融合。2.不同點(diǎn)三種基因編輯技術(shù)的差異ZFNTALENCRISRP系統(tǒng)識(shí)別模式蛋白質(zhì)DNA蛋白質(zhì)DNARNADNA靶向元件ZF array蛋白TALE array蛋白sgRNA蛋白切割元件Fok I蛋白Fok I蛋白Cas9蛋白識(shí)別長(zhǎng)度（3-6）x 3 x 2 bp(12-20) x 2 bp20 bp識(shí)別序列特點(diǎn)以3 bp 為單位5前一位為T3序列為NGC優(yōu)點(diǎn)平臺(tái)成熟、效率高于被動(dòng)同源重組設(shè)計(jì)較ZFN簡(jiǎn)單、特異性高靶向精確、脫靶率低、細(xì)胞毒性低、廉價(jià)缺點(diǎn)設(shè)計(jì)依賴上下游序列、