凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理及其消化

1、凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理及其消化、蒸餾以凱氏定氮法測(cè)定氮含量換算蛋白質(zhì)的方法，是國(guó)際上通用的標(biāo)準(zhǔn)方法，操作簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性和重現(xiàn)性都很好，廣泛用于各種食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。此法又分為常量、半微量、微量法三種。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為半微量凱氏定氮法。其測(cè)定原理相同，主要區(qū)別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多。而微量法則具有實(shí)驗(yàn)規(guī)模小，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。但微量法的準(zhǔn)確度和精密度比常量法要差一些。凱氏定氮法整個(gè)測(cè)定過(guò)程分為消解、蒸餾、滴定三步。凱式定氮法包括消化爐和蒸餾裝置，它們的結(jié)合能夠讓實(shí)驗(yàn)盡可能的簡(jiǎn)單。要使測(cè)定結(jié)果有更好的正確度、準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度，認(rèn)真細(xì)致掌握測(cè)定的每個(gè)步驟、各

2、個(gè)細(xì)節(jié)及相應(yīng)的注意事項(xiàng)，就顯得尤為重要。實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作1、主要試劑的配制40%氫氧化鈉：化學(xué)純400g氫氧化鈉溶于1000ml無(wú)氨蒸餾水中。2%硼酸：分析純20g硼酸溶于1000ml無(wú)氨蒸餾水中。0.05mol/L鹽酸：分析純4.2ml鹽酸定容至1000ml，通過(guò)無(wú)水碳酸鈉標(biāo)定?；旌现甘緞喊讶芙庥?5%乙醇的0.l%溴甲酚綠溶液5份和溶于95%乙醇的0.l%甲基紅溶液1份混合而成.2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程注意事項(xiàng)(1)樣品應(yīng)是均勻的。固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。固體樣品一般取樣范圍為0.20g2.00g;半固體試樣一般取樣范圍為2.00g5.00g;液體樣品取樣10.0mL25.0m

3、L(約相當(dāng)?shù)?0mg40mg)。若檢測(cè)液體樣品，結(jié)果以g/100mL表示。樣品應(yīng)是均勻的。固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。(2)樣品放入定氮瓶?jī)?nèi)時(shí)，不要沾附頸上。萬(wàn)一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結(jié)果偏低，或者用濾紙包裹好一起投入消化，濾紙影響通過(guò)空白扣除。消化時(shí)應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對(duì)樣品徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數(shù)滴過(guò)氧化氫后，再繼續(xù)加熱消化至完全。(3)消化時(shí)，不要用強(qiáng)火。若樣品含糖高或含脂及較多時(shí)，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑減少泡

4、沫產(chǎn)生。在整個(gè)消化過(guò)程中保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無(wú)硫酸存在的情況下，使氮有損失。海能公司消解爐SH220或SH520能夠很好的解決此問(wèn)題。(4)如硫酸缺少，過(guò)多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失，這樣會(huì)形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當(dāng)硫酸過(guò)多的被消耗或樣品中脂肪含量過(guò)高時(shí)，要增加硫酸的量;加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點(diǎn);催化劑硫酸銅在有機(jī)物全部消化后，溶液顯清澈透明的藍(lán)綠色，可用它來(lái)指示消化終點(diǎn)。此外，硫酸銅還可用做下一步蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑。過(guò)氧化氫，為氧化劑，有助于有機(jī)物消化，同時(shí)可以消除消化過(guò)程中的氣泡現(xiàn)象。(5)向蒸餾器瓶中加入濃堿時(shí)，往往出現(xiàn)褐色沉淀

5、物，這是由于分解促進(jìn)堿與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時(shí)銅離子與氨作用，生成深蘭色的結(jié)合物Cu(NH3)42 ，加入氫氧化鈉是否足量,常常影響整個(gè)測(cè)定的順利進(jìn)行。由反應(yīng)原理可知，當(dāng)氫氧化鈉足量時(shí)有黑色氧化銅生成而使溶液呈淡黑色;當(dāng)氫氧化鈉量不足時(shí)就無(wú)黑色氧化銅產(chǎn)生而使溶液呈淡藍(lán)色，所以有無(wú)氧化銅顏色存在是判斷氫氧化鈉是否足量的標(biāo)志。(6)因蒸餾時(shí)反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力，故可將氨帶出。所以，蒸餾時(shí)，蒸氣要發(fā)生均勻，充足，蒸餾中不得?；饠鄽?，否則，會(huì)發(fā)生倒吸。停止蒸餾時(shí)，由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應(yīng)室外層，所以，操作時(shí)，應(yīng)先將冷凝管下端提高

6、液面并清洗管口，再蒸一分鐘后關(guān)掉熱源。蒸餾是否完全，可用精密PH試紙測(cè)冷凝管口的冷凝液來(lái)測(cè)定，中性則說(shuō)明已蒸餾完全。一般情況下建議使用半微量法，因?yàn)槿绻麴s失敗的話，半微量法還可繼續(xù)蒸餾，而常量法只好全部重來(lái)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。我們使用海能K9840經(jīng)過(guò)多次蒸餾吸收實(shí)驗(yàn)達(dá)到理想效果。(7)混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒(méi)有溴甲酚綠，可單獨(dú)使用0.1%甲基紅乙醇溶液。(8)吸收液也可以用0.01當(dāng)量的酸代表硼酸，過(guò)剩的酸液用0.01N堿液滴定，而以硼酸為氨的吸收液，可省去標(biāo)定堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴(yán)格，亦可免去用移液管，操作比較簡(jiǎn)便。另外，硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40，否則氨吸收減弱，造成檢測(cè)結(jié)果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。(9)在鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制時(shí)，