纈沙坦對自體移植靜脈內(nèi)膜Fas、FasL表達(dá)的影響

1、纈沙坦對自體移植靜脈內(nèi)膜Fas、FasL表達(dá)的影響                        摘要】  目的：觀察纈沙坦對兔頸部自體移植靜脈內(nèi)膜增生、Fas、FasL表達(dá)的影響，探討血管緊張素1型受體（AT1）拮抗劑干預(yù)移植靜脈再狹窄的作用和機(jī)制。方法：雄性新西蘭大白兔20只行頸部自體靜脈移植手術(shù)，對照組予普通飼料飼養(yǎng)，纈沙坦組予普通飼料+纈沙

2、坦飼養(yǎng)，4周后取出靜脈移植物行血管形態(tài)學(xué)檢查，免疫組化方法檢測Fas、FasL表達(dá)情況。結(jié)果：對比對照組，纈沙坦組移植靜脈新生內(nèi)膜厚度及面積明顯減輕(P<0.01)，F(xiàn)as、FasL表達(dá)增加（P<0.05）。結(jié)論：纈沙坦可以顯著抑制兔自體移植靜脈新生內(nèi)膜的形成，其機(jī)制與促進(jìn)內(nèi)膜Fas、FasL的表達(dá)、進(jìn)而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  血管緊張素1型受體拮抗劑；自體移植靜脈；Fas；Fas配體    Abstract   Objective：To investigate the effect of Valsar

3、tan on intimal proliferation, and the expression of Fas and FasL on neointima，and to explain its mechanism of preventing restenosis in rabbit autogenous vein graft. Methods：20 male New Zealand White rabbits were randomly divided into two groups. The right external jugular veins of 20 rabbits were in

4、terposed between ipsolateral common carotid arteries. The control group was fed with common diet, and the treatment group was fed with common diet and valsartan (10mg·kg-1 ·d-1) . At the end of 4 weeks, the vein grafts were harvested and examined with pathologic and morphologic analysis. F

5、as and FasL on neointima were analyzed with immunohistochemical method. Results：Compared with the control group, the neointimal thickness and size were reduced in the treatment group (P<0.01). The expression of Fas and FasL in the treatment group was significantly higher than that in the control

6、group(P<0.05). Conclusion：Valsartan could significantly prevent intimal hyperplasia in rabbit autogenous vein graft. The mechanism possibly invloved in its increasing the expression of Fas and FasL, and thus increasing the apoptosis of VSMC.    Key words   Angiotensin typ

7、e 1 receptor antagonists；Autogenous vein graft；Fas；FasL    在血管內(nèi)膜增生過程中，血管平滑肌細(xì)胞存在明顯的凋亡現(xiàn)象，在一定程度上減輕了再狹窄病變，F(xiàn)as- Fas配體（FasL）系統(tǒng)是移植血管再狹窄過程中的主要凋亡途徑1。本課題通過觀察纈沙坦對移植靜脈內(nèi)膜Fas、FasL表達(dá)的影響，探討血管緊張素1型（AT1）受體拮抗劑對移植靜脈內(nèi)膜增生的抑制作用及機(jī)制。    1   材料與方法    1.1   實驗動物

8、與分組   新西蘭大白兔20只（由南通大學(xué)實驗動物中心提供），體重2.5±0.5 kg，微生物控制級別為級，普通環(huán)境中喂養(yǎng)，自由飲水。隨機(jī)分成2組，每組10只：（1）對照組予自體靜脈移植手術(shù)，普通飼料飼養(yǎng)；（2）纈沙坦組在對照組自體靜脈移植手術(shù)基礎(chǔ)上予普通飼料+纈沙坦（10 mg·kg-1·d-1）喂養(yǎng)，兩組均飼養(yǎng)4周。    1.2   建立自體靜脈移植模型   兔手術(shù)前禁食、禁水4小時，建立耳緣靜脈通道，予3%異戊巴比妥按30 mg/kg行靜脈麻醉。仰臥位固定，頸部備皮，

9、頸前正中縱行切口，游離、切取頸外靜脈一段，肝素-生理鹽水沖洗、浸泡。游離右側(cè)頸總動脈，耳緣靜脈內(nèi)注射1%肝素1 ml/kg，使其肝素化，阻斷頸總動脈近、遠(yuǎn)段，切除相應(yīng)長度，靜脈倒置，采用8/0錦綸單絲線作端-端間斷吻合，約810針，兩端吻合完成后開放動脈夾排氣，確定靜脈橋通暢、無出血后，逐層縫合切口。送回單籠喂養(yǎng)，術(shù)后3天每日耳緣靜脈注射1%肝素1 ml/kg防治血栓，注射青霉素80萬單位預(yù)防感染。手術(shù)次日及取標(biāo)本當(dāng)日行血管彩色多普勒檢查，證實靜脈橋通暢。    1.3   取材、切片與Fas、FasL檢測   術(shù)后4周，再

10、予3%異戊巴比妥靜脈麻醉，游離靜脈移植物，快速、準(zhǔn)確切取所需移植物組織，置入10%甲醛中固定24小時，組織修整、洗滌，乙醇逐級脫水，二甲苯置換出組織塊中酒精，石蠟包埋，切片厚4 m，蘇木素-伊紅染色，封片，光鏡觀察。用Olympus BX50生物顯微鏡和北航醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計算血管腔內(nèi)膜的厚度、面積及中膜的厚度、面積。用S-P法進(jìn)行Fas、FasL免疫組化檢查，試劑盒購自Neo Markers公司，免疫組化陽性顆粒為棕黃色或棕褐色顆粒，分布在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中。在Olympus BX50顯微鏡和北航醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)上隨機(jī)計算5個400倍視野中陽性細(xì)胞數(shù)（P）及觀察細(xì)胞總數(shù)（A），得

11、出陽性細(xì)胞百分率（P/A，%）。    1.4   統(tǒng)計學(xué)方法   計量資料采用±s表示，數(shù)據(jù)分析使用Stata7.0統(tǒng)計軟件包。組間樣本均數(shù)比較采用非配對t檢驗，率的比較采用2檢驗，P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。    2   結(jié)     果    2.1   動物情況   實驗過程中動物無死亡，術(shù)后切口無感染，兩組移植靜脈無閉塞。  

12、                               2.2   HE染色切片計算機(jī)圖像分析    2.2.1   病理   肉眼可見對照組移植物管壁增厚，纈沙坦組管壁增厚不明顯。光鏡下，對照組移植物內(nèi)膜明顯增厚

13、，管腔縮小，內(nèi)膜下出現(xiàn)大量平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖，增殖的SMC排列紊亂，呈典型的分泌型細(xì)胞，細(xì)胞周圍有較多的膠原纖維，中膜稍有增厚；纈沙坦組內(nèi)膜增厚較對照組減弱，中膜SMC向內(nèi)膜下遷移、增殖較對照組明顯減輕，中膜增厚不明顯（圖1）。    2.2.2   移植靜脈管壁內(nèi)膜、中膜厚度及面積改變   對照組與纈沙坦組內(nèi)膜厚度及面積比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。對照組與纈沙坦組靜脈移植物中膜厚度、中膜面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。    2.3 

14、60; Fas、FasL免疫組化染色切片計算機(jī)圖像分析   Fas、FasL陽性表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈棕黃色染色，主要集中在新生內(nèi)膜。與對照組比較，纈沙坦組Fas、FasL的表達(dá)均增強(qiáng)（P<0.05）（表2，圖2，3）。    3   討     論    動脈旁路移植術(shù)后靜脈移植物的再狹窄嚴(yán)重影響了手術(shù)療效。目前認(rèn)為，中膜SMC向內(nèi)膜下移行、增殖及表型改變、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，是移植物再狹窄的主要病理基礎(chǔ)。血管緊張素（Ang）與AT1結(jié)合，在

15、移植靜脈再狹窄過程中發(fā)揮重要作用。本研究中，纈沙坦組內(nèi)膜厚度減少61.55%，內(nèi)膜面積減少48.28%，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而兩組靜脈移植物中膜厚度中膜面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明自體靜脈移植術(shù)后，移植物內(nèi)膜增生是移植物失效的主要原因。使用AT1受體拮抗劑在受體水平阻止Ang與受體的結(jié)合，阻斷不同來源的Ang效應(yīng)，能有效減輕血管內(nèi)膜的增生。    在血管內(nèi)膜增生過程中，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）存在明顯的凋亡現(xiàn)象，在一定程度上減輕了再狹窄病變，F(xiàn)as、FasL系統(tǒng)是移植血管再狹窄過程中的主要凋亡途徑。Fas又稱Apo-

16、1或CD95，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的型跨膜糖受體，在多種組織和細(xì)胞均有表達(dá)，具有325個氨基酸，相對分子質(zhì)量45kDa，屬于腫瘤壞死因子和神經(jīng)生長因子受體家族。Fas配體是細(xì)胞表面的型膜蛋白，具有218個氨基酸，相對分子質(zhì)量為26 kDa，屬于腫瘤壞死因子亞家族。Fas與FasL結(jié)合后，向表達(dá)Fas的細(xì)胞傳遞死亡信號，引起細(xì)胞凋亡。實驗證明，對經(jīng)腺病毒預(yù)先免疫的動物感染可控的腺病毒或Adp21，會導(dǎo)致強(qiáng)烈的T細(xì)胞移行至血管壁，而用含有FasL腺病毒基因有效轉(zhuǎn)染則抑制T細(xì)胞激活，從而減少損傷后血管新生內(nèi)膜的形成2。很多體內(nèi)體外實驗也證實了VSMC對FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的易感性，體外培養(yǎng)的VSMC在編

17、碼FasL的復(fù)制缺陷腺病毒載體感染后出現(xiàn)凋亡，腺病毒編碼FasL轉(zhuǎn)染球囊損傷的大鼠頸動脈后局部表達(dá)，可以誘導(dǎo)增生的SMC產(chǎn)生凋亡進(jìn)而有效抑制新生內(nèi)膜的增厚3。    本試驗中纈沙坦組Fas及FasL的表達(dá)均較對照組增加（P<0.05），表明纈沙坦可促進(jìn)新生內(nèi)膜表達(dá)Fas及FasL，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制新生內(nèi)膜增厚、減輕移植靜脈的再狹窄。楊彬等4將洛沙坦應(yīng)用于大鼠動脈損傷模型，證實可以促進(jìn)Fas、FasL在VSMC的表達(dá)，減輕血管損傷后的增生性重塑。梁緒國等5采用洛沙坦對體外培養(yǎng)VSMC凋亡及相關(guān)基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)洛沙坦增強(qiáng)Fas表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，促

18、進(jìn)VSMC的凋亡。我們將纈沙坦應(yīng)用于兔頸部自體靜脈移植模型，研究結(jié)果與上述實驗相符。纈沙坦能抑制移植靜脈內(nèi)膜增生其機(jī)制可能與促進(jìn)Fas、FasL表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)VSMC凋亡有關(guān)。【參考文獻(xiàn)】  1 Walsh K, Smith RC, Kim HS. Vascular cell apoptosis in remodeling, restenosis, and plaque ruptureJ. Circ Res, 2000, 87(3):184-188.2 Luo Z, Sata M, Nguyen T, et al. Adenovirus-mediated delivery of fas ligand inhibits intimal hyperplasia aft