分子生物學(xué)課件3dna復(fù)制及轉(zhuǎn)錄

1、第四節(jié) 真核生物DNA的 與原核生物DNA的相同之處：1. 都是半保留、半不連續(xù)2. 、延伸、終止3. 都必須有SSB和DNA聚合酶等的參與1. 真核生物DNA的特點(diǎn)上可以有多處起始點(diǎn)，原核子的大小是不均一的，從 13900Kb不等。要由引物轉(zhuǎn)錄觸發(fā);在全部完成之前，各個(gè)起始點(diǎn)不能再開始;而在快速生長(zhǎng)的原核生物中，復(fù)子原點(diǎn)的DNA序列并無(wú)固定的模式，2.真核生物DNA聚合酶l 時(shí)均以四種脫氧核糖核苷三磷酸為底物l 需Mg2+ 激活l 模板和引物3,-OHl 鏈的延伸5，-3，。真核生物的DNA聚合酶從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離出5種DNA聚合酶： DNA-pola引物，pola/引物和延伸鏈的雙重功能

2、。DNA-pol DNA損傷修復(fù)，沒有其他pol時(shí)才起作用DNA-pol 催化線粒體DNA的DNA-pol 中延長(zhǎng)前導(dǎo)鏈和后隨鏈具有高度前進(jìn)動(dòng)力(RF-C和PCNA)DNA-pol 校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口，主要與后隨鏈有關(guān)。DNA聚合酶) ()DNA聚合酶(DNA聚合酶(M)DNA聚合酶()DNA聚合酶()定位細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體細(xì)胞核細(xì)胞核數(shù)目41221外切酶活性無(wú)無(wú)35外切酶35 外切酶35外切酶引物 酶活性有無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)持續(xù)能力中等低高有PCNA時(shí)高高生物學(xué)功能引物合成修復(fù)線粒體DNA合成核DNA修復(fù)， 后隨鏈的DNA的回環(huán)模型真核生物岡崎片段RNA引物的去除：由一種可特異性切除DNA- RNA

3、雜合底物的RNAaseH1發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的活性，在靠近RNA與DNA的連接處切開引物，由具備5-3外切酶活性的MF1蛋白降解RNA 片段。DNA連接酶I特異性的用于封閉岡崎片段之間的缺口。3.真核生物DNA端粒的 原核生物的 是環(huán)狀的，其5最末端岡崎片段的RNA 引物去除后，可用另半圈DNA鏈作為引物向前延伸填補(bǔ)空隙。 真核生物是線性DNA，其末端RNA 引物被切除后，沒有可用做引物的3-OH末端，空缺如果不能填補(bǔ)，從而會(huì)使5 末端序列因此而縮短。 真核生物通過(guò)形成端粒結(jié)構(gòu)來(lái)解決這個(gè)問題。telomere replication 端粒Figure 13.24. Two of the reaso

4、ns why linear DNA molecules could become shorter after DNA replication(Genomes, 2 ed, Brown) (Genomes, 2 ed, Fig 12-23, Brown) 端粒 真核生物 的兩個(gè)末端序列，一段簡(jiǎn)單的串聯(lián)重復(fù)序列組成，幾百到幾千個(gè)bp。生物學(xué)功能是保持 末端結(jié)構(gòu)的 ，防止 間末端連接，并可補(bǔ)償后隨鏈5端去除RNA 引物后造成的空缺，防止時(shí)末端丟失， 決定細(xì)胞 ，固定 的位置。 端粒酶 一種含RNA的蛋白質(zhì)復(fù)合體，所含RNA鏈約長(zhǎng)150 nt，并約含15個(gè)拷貝的CyAx重復(fù)序列，是合成端粒TxGy股的

5、模板。端粒酶實(shí)際是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它催化互補(bǔ)于RNA 模板的DN 段的 。Figure 13.25. Extension of the end of a human chromosome by telomerase. The 3 end of a human chromosomal DNA molecule is shown. The sequence comprises repeats of the human telomere motif 5-TTAGGG-3. The telomerase RNA base-pairs to the end of the DNA molecule whic

6、h is extended a short distance, the length of this extension possibly determined by the presence of a stem-loop structure in the telomerase RNA ( Tzfati et al., 2000). The telomerase RNA then translocates to a new base-pairing position slightly further along the DNA polynucleotide and the molecule i

7、s extended by a few more nucleotides. The process can be repeated until the chromosome end has been extended by a sufficient amount, andcontrolled by telomere binding protein. (Genomes, 2 ed, Fig 12-24, Brown)端粒是真核生物兩端簡(jiǎn)單重復(fù)序列，非常保守。端粒酶識(shí)別富含G的端粒序列，并將新的重復(fù)的端粒序列添加到染色體DNA的3端。端粒酶的發(fā)現(xiàn) 1972年，JD.Watson發(fā)現(xiàn)： DNA 聚合

8、酶不能夠完整地線性染色質(zhì) 5末端的引物脫落后，DNA聚合酶不能完成最后的，留下一個(gè)單鏈的間隙 如果這一間隙不能夠被填充，DNA將失去這一DN斷 每經(jīng)過(guò)一次、，就將丟失一部分的端粒結(jié)構(gòu)，影響到與端粒相鄰的一些重要基因When telomerase activity is repressed端粒閾值細(xì)胞細(xì)胞停止或 1985，CW.Greider和EH.Blackburn發(fā)現(xiàn)：將一段單鏈的末端寡聚核苷酸加至四膜蟲的提取物中后，端粒的長(zhǎng)度延長(zhǎng)了，這就說(shuō)明了切實(shí)有這樣的一種酶，“端粒酶”（telomerase） 。u Telomerase activity is repressed in somatic

9、 cells of multicelluar organisms resulting in a gradual shortening of the chromosome with each cell generation. As this shortening reaches informational DNA, the cells senesce and die.u 端粒酶的活性在多細(xì)胞生物的體細(xì)胞中受到抑制，每會(huì)逐漸短縮。這也就縮短了代子細(xì)胞的區(qū)域，導(dǎo)致細(xì)胞的衰老。DNA在大多數(shù)的正常人的體細(xì)胞中沒有活性近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)： 衰老者端?？s短 大約在85%-95%的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了端粒酶 活

10、性。端粒酶端粒丟失與衰老 端粒丟失是衰老的？還是結(jié)果？ 目前的研究結(jié)果還處在探索階段，各種關(guān)于端粒/ 端粒酶參與細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化的證據(jù)大多比較粗 淺，而且，尚未被證實(shí)。端粒、端粒酶與v 人細(xì)胞：均呈現(xiàn)端粒酶活性v 正常體細(xì)胞：檢測(cè)不到端粒酶活性v 84.8%的具有活化狀態(tài)的端粒酶。對(duì)癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)： 永生化是癌細(xì)胞所具有的顯著行為 端粒酶被激活的細(xì)胞也具有永生化行為 癌細(xì)胞具有端粒酶被激活的細(xì)胞所具備的特性 抑制端粒酶活性，使永生化細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜?xì)胞癌細(xì)胞通過(guò)分泌大量端粒酶來(lái)防止端粒縮短，以便不斷繁殖端粒酶缺乏同樣會(huì)引起哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家：對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行了基因改造，使 其體內(nèi)缺乏端粒酶以及一些抗

11、癌蛋白質(zhì)（p53），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)鼠患上了鼠類通?；嫉娜祟惼鞴偕掀ぜ?xì)胞癌 研究表明：端粒酶缺乏同樣會(huì)引起衰老端粒/端粒酶 衰老可能是由端粒的縮短所致， 以阻止衰老激活端粒酶似乎可，端粒酶一旦被重新激活，細(xì)胞又將成為永生 化細(xì)胞，繼而衍變?yōu)榘┘?xì)胞 如何能恰當(dāng)、正確的發(fā)揮端粒/端粒酶在解決衰老與中的作用？生命科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)極具性的課題4.DNA的調(diào)控原核生物DNA的調(diào)控細(xì)胞 叉的多少?zèng)Q定了 起始的頻率，而 起始的頻率還受各種蛋白質(zhì)因子和RNA的調(diào)節(jié)；p 模板的轉(zhuǎn)錄激活和 DnaA 蛋白起始頻率的重要因素，正調(diào)控作用，依賴于 和蛋白質(zhì)的濃度和共價(jià)修飾。p 另外也有一些負(fù)調(diào)控的例子，如大腸桿菌質(zhì)粒Col

12、E1 調(diào)控。反義RNA的 阻止了RNaseH的識(shí)別，抑制引物的 。真核生物DNA的調(diào)控 細(xì)胞生活周期 水平 子水平 細(xì)胞生活周期G1期，此時(shí)期決定著是否，一切條件成熟才能進(jìn)入S 期進(jìn)行DNA的。G2期，此期決定著是否進(jìn)行有絲，即進(jìn)入M期。檢驗(yàn)否完成，DNA有無(wú)損傷等。 水平與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA甲基化以及轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。通?；钚詤^(qū) 先；常染色質(zhì)區(qū)先，異染色質(zhì)區(qū)后。異染色質(zhì)：間期，處于高度凝聚狀態(tài)的染色質(zhì)。常染色質(zhì)：上凝聚較松散的區(qū)域，處于常染色質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)錄活躍。 子水平起始轉(zhuǎn)錄激活、起始復(fù)合物的形成、RNA引物的以及底物、蛋白質(zhì)和酶的供應(yīng)等，這些條件都對(duì) 的起始起著調(diào)控作用。5 轉(zhuǎn)錄與5.1 原

13、核生物的基因轉(zhuǎn)錄5.2 真核生物的基因轉(zhuǎn)錄5.3 轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)錄（transcription）轉(zhuǎn)錄指以DNA為模板，由RNA聚合酶催化，以4種核苷三磷酸（NTP）為原料，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)RNA的過(guò)程，模板 DNA酶RNA聚合酶（RNA polymerase) 原料 四種核糖核苷三磷酸ATP、UTP、GTP、CTP產(chǎn)物：RNA(+) strand is sense strand(-) strand issense strand對(duì)于一個(gè)基因來(lái)說(shuō)，DNA的兩條鏈中只有一條鏈作為RNA時(shí)的模 板，這條鏈叫做模板鏈（template strand），也稱為反（sense strand）；另一條鏈則稱為有（s

14、ense strand），又稱編碼鏈（coding strand） 轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，一個(gè)基因能否表達(dá)的關(guān) 鍵往往是在轉(zhuǎn)錄階段，闡明轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制對(duì)于了解 基因表達(dá)具有重要的作用。轉(zhuǎn)錄的過(guò)程：1.模板的識(shí)別2.轉(zhuǎn)錄起始3.轉(zhuǎn)錄延伸4.轉(zhuǎn)錄終止第一節(jié) 原核生物的基因轉(zhuǎn)錄1 原核生物的 RNA 聚合酶E.coli僅由一種聚合酶完成全部RNA（mRNA rRNA tRNA)的轉(zhuǎn)錄-RNA PlymeraseRNA聚合酶的組成：a2 b bw s全酶 =酶 + s各的功能a參與全酶與啟動(dòng)子的牢固結(jié)合，2a能與啟動(dòng)子上游元 件活化因子結(jié)合b負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始和延伸，催化中心，催化底物形成磷酸 二酯鍵，

15、與終止因子(RHo)發(fā)生直接反應(yīng)，抑制劑：霉素（起始)，鏈霉素(延伸）b負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合,僅有的可以單獨(dú)與DNA結(jié)合的參與RNA聚合酶與DNA模板的結(jié)合與轉(zhuǎn)錄的終止有關(guān)s 在啟動(dòng)子的識(shí)別中起關(guān)鍵作用，增強(qiáng)聚合酶與啟動(dòng)子的專一性結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始，對(duì)延伸不必需。沒有s的酶（稱為a2 b bw ）則稱為酶。K2 E. coli RNA polymerase155 KD36.5 KD11 KD36.5 KD70 KD151 KD465kdInitiation onlyBoth initiation & elongation2 大腸桿菌70啟動(dòng)子 啟動(dòng)子 是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA

16、序列，它的保守序列被RNA聚合酶或其他DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后可 以起始或調(diào)控轉(zhuǎn)錄。 因子在RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子的過(guò)程中起關(guān)鍵作用,大腸 桿菌至少有4種因子。70負(fù)責(zé)識(shí)別的啟動(dòng)子 32識(shí)別熱激蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子38負(fù)責(zé)識(shí)別碳源饑餓條件下的基因啟動(dòng)子因子的數(shù)量只有酶的30。Pribnow實(shí)驗(yàn)70大腸桿菌 啟動(dòng)子的確定大腸桿菌70啟動(dòng)子序列 位于 -4到-13，RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)，決定轉(zhuǎn)錄的起始位置。也稱為Pribnow盒。共有序列為TATAAT，-10序列與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間間隔59 bp，這一間隔序列是不保守的，但間隔序列的長(zhǎng)短很重要。序列 共有序列是TTGACA，對(duì)RNA聚合酶全酶有很高的

17、親和性，如果發(fā)生突變或缺失親和性將降低。-35序列被因子識(shí)別，又稱識(shí)別位點(diǎn)，決定轉(zhuǎn)錄頻率。在90的啟動(dòng)子中-35序列和-10序列相距1619 bp。這兩個(gè)保守元件之間的間隔序列對(duì)于啟動(dòng)子的功能并不重要。 TTGACA -16-19 bp- TATAAT -5-8 bp- ATG -35 sequence17bp-10 sequence+1ConsensusTTGACATATAATThe sequences of five E. coli promoterstranscription initiation, elongation and terminationPromoter bindingDN

18、AunwindingRNA chain initiationRNA chainterminationRNA chainelongationRho-dependent termination3 原核基因轉(zhuǎn)錄的起始 為使模板鏈能與堿基配對(duì)，轉(zhuǎn)錄起始時(shí)DNA雙螺旋必須局 部 。 從RNA聚合酶結(jié)合的啟動(dòng)子部位開始后，聚合酶從一個(gè)特定的核苷酸位點(diǎn)起始RNA鏈的 ，這一位點(diǎn)被稱為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，又被定義為基因序列的+1位置。原核生物轉(zhuǎn)錄起始分為四個(gè)階段1)合到DNA上（擴(kuò)散方式）。2) 起始識(shí)別,即RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，形成封閉型啟動(dòng)子復(fù)合物（-35序列）。3) 開放型起始復(fù)合物的形成， 即RNA 聚

19、合酶與-10 序列結(jié)合，解開雙鏈結(jié)構(gòu)， 出單鏈模板。4) 形成三元起始復(fù)合物，起始轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶與DNA的結(jié)合在因子的參與下，RNA聚合酶能夠特異性地、 地結(jié)合到基因的啟動(dòng)子序列上，即能夠識(shí)別啟動(dòng)子。RNA聚合酶全酶首先通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入 卷曲的DNA 分子，通過(guò)接觸、解離、再接觸、移動(dòng)的方式，RNA聚 合酶全酶在DNA上搜尋啟動(dòng)子，直到因子發(fā)現(xiàn)識(shí)別位 點(diǎn)-35序列。起始識(shí)別當(dāng)RNA聚合酶全酶發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的-35序列后，它與DNA分子 的結(jié)合由疏松變?yōu)槔喂?，形成封閉型的起始復(fù)合物。聚合酶是通過(guò)因子找到啟動(dòng)子的特異序列的，因子增 加酶與啟動(dòng)子的結(jié)合常數(shù)和停留時(shí)間，抑制隨機(jī)結(jié)合，能 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的專一

20、性。開放型起始復(fù)合物的形成RNA聚合酶全酶的一端與-35序列接觸后，通過(guò)某種變構(gòu)機(jī)制，整個(gè)酶分子向-10序列轉(zhuǎn)移，并與之牢固結(jié)合，雙螺旋 鏈解開，識(shí)別模板鏈。當(dāng)-10序列及起始位點(diǎn)處發(fā)生局部解鏈時(shí)，RNA聚合酶全酶與 啟動(dòng)子即形成開放型啟動(dòng)子復(fù)合物，RNA聚合酶在-10序列區(qū) 域緊密地與啟動(dòng)子結(jié)合。 TTGACA -16-19 bp- TATAAT -5-9 bp- ATG -35 sequence-10 sequence+1三元起始復(fù)合物的形成隨著開放型起始復(fù)合物的形成，DNA上形成長(zhǎng)約17個(gè)核苷酸的開鏈區(qū)，即轉(zhuǎn)錄泡。RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始加入第一個(gè)核苷三磷酸。當(dāng)另外一種能夠與模板形

21、成配對(duì)氫鍵的核苷酸填充了延伸位點(diǎn)時(shí)，兩個(gè)位點(diǎn)上的核苷酸Transcription bubble第一個(gè)磷酸二酯鍵，形成三元復(fù)合物RNA-DNA-RNA聚合酶。Core promoter region includingSextama Boxv -35 Site. RNApol. loosely binding site；v RNApol. recognition site（R site）v TTGAC (Sextama Box)Pribnow Boxv -10 site RNApol. firmly binding site (B site)v TATAAT (pribnow Box)Initi

22、ation sitev+1 RNA transcriptional startpoint (I site) A/G-35 (R)-10 (B)+1 (I)最初，7580 bp 隨著因子的脫離， 只覆蓋3040 bp大腸桿菌聚合酶在轉(zhuǎn)錄起始階段的覆蓋情況4 原核RNA的延伸當(dāng)RNA上最初29個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)錄出來(lái)后，因子即從全酶上解離，酶與模板的親和性下降到與非特異性位點(diǎn)結(jié)合的水平，在DNA鏈上容易移動(dòng)，為RNA鏈的延伸創(chuàng)造了條件。出來(lái)的以再與其它酶結(jié)合重新起始轉(zhuǎn)錄。Elongation Add ribonucleotides to the 3-end The RNA polymerase exten

23、d the growing RNA chain in the direction of 5 3 （E. coli: 40 nt/sec) The enzyme itself moves in 3 to 5 along the sense DNA strand.影響RNA鏈延伸的速度的因素(1) RNA聚合酶 Ecoli的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄T7 DNA的速度為17 個(gè)核苷酸/s，而T7酶轉(zhuǎn)錄速度可達(dá)100200個(gè)核苷酸/s。(2) 暫停信號(hào) 當(dāng)RNA聚合酶遇到特殊序列時(shí)，轉(zhuǎn)錄速度會(huì)突然出現(xiàn)變化，可小于0.1個(gè)核苷酸/s，這段序列稱為暫停信 號(hào)。暫停狀態(tài)的模板鏈多為GC富集區(qū)或反向重復(fù)序列。(3)

24、其它配基 離體實(shí)驗(yàn)中ppGpp能影響延伸速度，大腸桿菌nusA蛋白也有調(diào)節(jié)延伸速度的功能。5 原核基因轉(zhuǎn)錄的終止轉(zhuǎn)錄終止 RNA 的終止和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的 。當(dāng)RNA聚合酶沿著模板移動(dòng)遇到轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列 時(shí)，不再把底物逐個(gè)加到RNA 3-OH端，而是從DNA 模板上解離。終止子：在模板DNA分子上(基因末端） 有終止轉(zhuǎn)錄的特殊堿基序列，成為終止子。所有原核和某些真核生物的終止子要求轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA 3端具有發(fā)夾的二級(jí)結(jié)構(gòu)，莖部富有GC序列。不依賴于因子的終止子、依賴于因子的終止子n 不依賴于因子的終止子1.在終止子序列上有富含GC的二重對(duì)稱性結(jié)構(gòu)，約1520個(gè)核苷酸。2.之后有大約為68個(gè)A的堿 基，最終轉(zhuǎn)錄成RNA末端的一連串U。轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物具有一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)和隨后一段富含寡聚U的片段。RNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可能會(huì)酶中，使核心酶難于向前移動(dòng)而發(fā)生暫停；RNA鏈的段寡聚U序列與DNA模板上的寡聚A 通過(guò)氫鍵配對(duì)。由于AU之間的氫鍵和堿基 堆集力都很弱，使雙鏈容易解開，不需要 因子便造成了轉(zhuǎn)錄停止。這種不需要輔助因 子的終止子又稱為強(qiáng)終止子。Figure 10.3. Termination at an intrinsic terminator. The presence of an inverted palindrome in the DNA sequence resu