Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量精

1、實驗報告綜合試驗(三Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量2010年6月3日摘要:本實驗包括兩個步驟，第一個步驟為制作標準曲線，第二個步驟為制備樣品(牛奶和酪蛋白粗制品并用Folin一酚法進行蛋白質(zhì)含量的測定右到酶原液蛋白含量為8923(ug/ml;洗脫峰I蛋白含量82.692(ug/ml;洗脫峰H蛋白含量121.923(ug/ml;洗脫峰田蛋白含量83.077(ug/ml。此次實驗與理論值仍存著一定的偏差。通過本次實驗的操作以及對實驗結(jié)果的分析，了解Folin一酚法準確測定蛋白含量的原理方法，以及其相關(guān)的影響因素。一、實驗目的：1、測定實驗中原液和洗脫液中蛋白質(zhì)的含量2、掌握Folin-酚法測定蛋白

2、質(zhì)含量的原理和方法。3、熟悉分光光度計的操作。、理論背景:Folin-酚試劑法包括兩步反應：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡合物；第二步是此絡合物將磷鋁酸-磷鴇酸試劑(Folin試劑還原，產(chǎn)生深藍色微鋁藍和磷鴇藍混合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮版法高100倍，定量范圍為5100小或白質(zhì)。Folin試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和琉基化合物均有干擾作用。止匕外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。、實驗裝置:1.實驗材料原液,洗脫峰2.儀器（1移液管（0.5mL、1mL、5mL（2量筒

3、（3分光光度計（4移液管、移液槍3.試劑（純度均為分析純（10.5mol/LNaOH（2試劑甲： （A稱取10gNa2CO3,2gNaOH和0.25g酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸儲水定容至500mL。（B稱取0.5gCuSO45H2O,溶解后用蒸儲水定容至100mL。每次使用前將（A液50份與（B液1份，即為試劑甲，其有效期為1d過期失效。（3試劑乙:在1.5L容積的磨口回流器中加入100g鴇酸鈉（Na2WO42H2O和700mL蒸儲水，再加50mL85%磷酸和100mL濃鹽酸充分混勻，接上回流冷凝管，以小火回流10h?；亓鹘Y(jié)束后，加入150g硫酸鋰和50mL蒸儲水及數(shù)滴液體澳，開口繼續(xù)沸騰15mi

4、n，驅(qū)除過量的澳，冷卻后溶液呈黃色（倘若仍呈綠色,再滴加數(shù)滴液體澳，繼續(xù)沸騰15mino然后稀釋至1L,過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存，使用前大約加水1倍，使最終濃度相當于1mol/L。（4標準牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精確稱取0.0250g結(jié)晶牛血清白蛋白，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸儲水溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，燒杯內(nèi)的殘液用少量蒸儲水沖洗數(shù)次， 沖洗液一并倒入容量瓶中， 用蒸儲水定容至100mL,則配成250仙g/mL的牛血清白蛋白溶液。（試劑已配好四、實驗步驟1、標準曲線的制作(1系列標準牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通試管，按表1加入標準濃度的牛血清白蛋白溶液和蒸儲水,配成一系列

5、不同濃度的牛血清白蛋白溶液，做兩組平行。然后各加試劑甲5mL,混合后在室溫下放置10min，再各加0.5試劑乙，立即混合均勻(這一步速度要快，否則會使顯色程度減弱。30min后，以不含蛋白質(zhì)的1號試管為對照，用分光光度計于650nm波長下測定各試管中溶液的光密度并記錄結(jié)果。表1牛血清白蛋白標準曲線制作123456牛血清白蛋白溶液(mL00.20.40.60.81.0蒸儲水(mL4 .00.80.60.40.20(2標準曲線的繪制：以牛血清白蛋白含量(以g/m為橫坐標，以光密度平均值為縱坐標繪制標準曲線。2、樣品的制備及測定從分離峰中各取1ml溶液， 分別加入試劑甲5ml,混勻后放置10min，

6、 在各加試劑乙0.5ml,迅速混勻，室溫放置30min，于650nm波長下測定光密度，并記錄數(shù)據(jù)。五、注意事項:進行測定時，加Folin試劑要特別小心，因為Folin試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但此實驗的反應只是在pH10的情況下發(fā)生，所以當加試劑乙（Folin試劑時，必須立即混勻，以便在磷鋁酸-磷鴇酸試劑被破壞之前即能發(fā)生還原反應，否則會使顯色程度減弱。六、實當結(jié)果：表1-1標準牛血清白蛋白標準曲線數(shù)據(jù)處理牛血清白蛋白標準曲線123456牛血清白蛋白溶液（mL00.20.40.60.81.0蒸儲水（mL1.00.80.60.40.20牛血清白蛋白含量（ug/ml050100150200250

7、A650nm0.0000.1330.2750.3830.5110.648牛血清白蛋白標準曲線(2樣品測試結(jié)果XA650nmi-i1-2平均淀粉iW液0,1150.1170.116洗脫峰10.2140.2160.215洗脫峰n0.3150.3180.317洗脫峰in0.2160.2150.216蛋白含量根據(jù)標準曲線得出方程y=0.0026X計算,蛋白質(zhì)含量按下式計算：X(ug=A*稀釋倍數(shù)/K蛋白含量(ug/ml=X(ug/體積(mlA-測得的光密度K-標準曲線斜率因此：淀粉酶液蛋白含量0.116*200/(1*0.0026=8923(ug/ml洗脫峰I蛋白含量0.215*1/(1*0.0026

8、=82.692(ug/ml洗脫峰II蛋白含量0.317*1/(1*0.0026=121.923(ug/ml洗脫峰田蛋白含量0.216*1/(1*0.0026=83.077(ug/ml七、討論1、此次實驗步驟較為簡單，能較好的掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法;更加熟悉分光光度計的使用，并且測定出蛋白質(zhì)含量。總體實驗較為成功。2、誤差分析實驗結(jié)果有一定的偏差，可能原因如下：(1)樣品所含各種氨基酸的比例與標準有所不同，而不同氨基酸比例不同對實驗結(jié)果有影響，有的較大有的較??；(2)加入乙液應立即不斷振蕩，每次實驗振蕩程度對顯色結(jié)果有影響，而且時間不及時時造成的誤差更大；(3)所使用分光

9、光度計的數(shù)值不穩(wěn)，也會造成一定誤差。尤其是酪蛋白的實驗中用已經(jīng)比色的比色皿在其他儀器上誤差加大，因為沒有對照實驗溶液，只好實驗，誤差加大了；(4)比色皿不夠清潔，30min時間未到就拿去分光光度計測也造成了一定誤差。思考題解答1、查閱課本、參考書，試述有幾種測定蛋白含量的方法，及其簡要原理和優(yōu)、缺點。測定方法原理靈敏度干擾物質(zhì)優(yōu)點缺點凱氏定氮蛋白質(zhì)中的氮通過硝化靈敏度低，非蛋白氮法全部轉(zhuǎn)變成無機氮，再通適用于（Kjedahl過分析化學的手段測出0.21.0mg法）氮的含量，根據(jù)氮在蛋白氮，誤差為質(zhì)分子中的平均含量2%16%,即可求得樣品中蛋白質(zhì)含量雙縮月尿法具有兩個或兩個以上肽靈敏度低硫酸??；

10、Tris緩沖液；某些氨基酸各種喋吟和喀噬；各種核甘酸（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）硝化樣品耗時繁瑣不需可溶裝置需大量樣對所有蛋品白質(zhì)的測不是檢測蛋白量都是一質(zhì)而是檢測氮致的簡便迅速缺乏專一性靈敏度較差（Biuret鍵的化合物皆有雙縮月尿120mg法） 反應， 因此蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與Cu2+形成紫紅色化合物，顏色深淺與蛋白濃度成正比紫外分光蛋白質(zhì)分子中酪氨酸色較為靈敏光度法氨酸在280nm左右具有50100g最大吸收，由于在各種蛋白質(zhì)中這幾種氨基酸含量差別不大，所以蛋白質(zhì)在280nm的吸收值與濃度具正相關(guān)不受蛋白所需樣品量在質(zhì)特異性（0.21.7）的影響mg/ml方法簡便測定迅速收無干擾

11、若樣品蛋白中酪氨酸含量與比較差別較大誤差，其他具有紫外吸收的物質(zhì)有干擾樣品可回標準蛋白質(zhì)相低濃度鹽時，測定有一定考馬斯亮考馬斯亮藍G-250在酸靈敏度最藍G250性溶液中為棕紅色當它高染色法與蛋白質(zhì)通過范德華鍵15g （Bradford結(jié)合后變?yōu)樗{色且在蛋法白質(zhì)一定濃度范圍內(nèi)符合比爾定律可在595nm處比色測定Folin-酚蛋白質(zhì)與銅在堿性條件靈敏度高試劑法下生成銅絡合物，將磷鋁51W8酸-磷鴇酸試劑還原，產(chǎn)生的顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比預習時疑問解答強堿性緩沖液；TritonX-100;SDS操作簡便不同蛋白質(zhì)之迅速消耗問差異大且標樣品量少準曲線線性差酚類、檸檬反應靈敏，花費時間較長，酸、琉操作簡單，干擾因素多，不（qiu）基顯色作用穩(wěn)定，反應只在化合物較好極短時間內(nèi)有效（1）為什么加入甲試劑混合后要在室溫下放置10min?答：反應完全充分，已經(jīng)優(yōu)化的時間。（2）為什么加入已試劑混合均勻后要30min后才進行波長測定？答：反應完全充分，已經(jīng)優(yōu)化的時間。八、結(jié)論：此次試驗較為簡單，利用蛋白質(zhì)與銅在堿性條件下生成蛋白質(zhì)-銅絡合物，將磷鋁酸-磷鴇酸試劑，即Folin試劑還原，產(chǎn)生的顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比的原理進行實驗。我們得出的實驗結(jié)果為酶原液、洗脫峰I、洗脫峰H、洗脫峰田的蛋白含量分別為8923(ug/ml、82.692(ug/ml、121.92