塞來(lái)昔布聯(lián)合卡培他濱對(duì)裸鼠人肝癌模型中腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影

1、塞來(lái)昔布聯(lián)合卡培他濱對(duì)裸鼠人肝癌模型中腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響         10-05-10 15:20:00     編輯：studa20                 作者：黃新余，王洪成，潘燁，戚大川，艾開(kāi)興，鄭起【摘要】  目的 研究環(huán)氧化酶-2抑制劑塞來(lái)昔布(Celecoxib)和化療藥物卡培

2、他濱(Capecitabine)對(duì)裸鼠人肝癌模型中腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法 建立LIC-D35裸鼠人肝癌模型，成瘤后40只裸鼠隨機(jī)分成4組即對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、卡培他濱組、聯(lián)合用藥組(卡培他濱與塞來(lái)昔布)。觀察腫瘤大小，計(jì)算抑瘤率;采用RT-PCR方法觀察腫瘤中COX-2的mRNA表達(dá)，并應(yīng)用免疫組化法Ki-67檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖水平、末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。結(jié)果 對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、卡培他濱組、聯(lián)合組瘤體體積分別為(3 880±438)mm3、(3 374±465)mm3、(1 859±362)mm3和(981±197)

3、mm3;塞來(lái)昔布組、卡培他濱組、聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為15%、45%和71%。四組中Ki-67陽(yáng)性率分別為46%、32%、25%和11%;腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)DI分別為8%、22%、27%和38%;塞來(lái)昔布組、聯(lián)合組腫瘤組織中COX-2 mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組和卡培他濱組(P<0.01)。結(jié)論 塞來(lái)昔布可顯著抑制裸鼠人肝癌模型中腫瘤細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞Ki-67表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。與卡培他濱聯(lián)合應(yīng)用可提高抗腫瘤效果。 【關(guān)鍵詞】  環(huán)氧化酶-2抑制劑;裸鼠;肝腫瘤Abstract Objective To evaluate the effect of

4、celecoxib combined with capecitabine on proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma in nude mice.Methods LIC-D35 liver tumors were orthotopically implanted in 40 nude mice and divided randomly into 4 groups:the control group(A)，the celecoxib group(B)，the capecitabine group(C)and the cele

5、coxib combined with capecitabine group(D).Results Tumor volume was(3 880±438)mm3，(3 374±465)mm3，(1 859±362)mm3，(981±197)mm3 in the control，celecoxib，capecitabine and combined group，respectively.The rate of tumor inhibition was 15% in the celecoxib group，45% in the capecitabine gr

6、oup and 71% in the combined group.Immunohistochemical assays for tumor proliferation(Ki-67)showed the tumor cell proliferation Ki-67 positive rate was 46%,32%,25%，11% respectively and apoptosis index(TUNEL)was 8%，22%，27%，38%，respectively.The expression of COX-2 mRNA by RT-PCR method in celecoxib gro

7、up and combined group showed it was highly suppressed compared with the control group and capecitabine group.Conclusion Celecoxib can suppress the expression of COX-2 mRNA of tumors orthotopic implanted in nude mice，it reduce proliferation and induce apoptosis of tumor cell;By combine with capecitab

8、ine，it can improve its anti-tumor activities.Key words COX-2 inhibitor;nude mice;hepatocellular carcinoma研究表明，環(huán)氧化酶-2抑制劑可抑制腫瘤增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡1。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶抑制劑可增強(qiáng)腫瘤放射和化療敏感性2，3。但也有不同報(bào)道。文獻(xiàn)中環(huán)氧化酶-2抑制劑在肝癌中的研究報(bào)道很少，其抗癌作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用人肝癌裸鼠模型(LIC-D35)，對(duì)塞來(lái)昔布聯(lián)合卡培他濱在人肝癌裸鼠模型中腫瘤抑制作用進(jìn)行研究，并探討其作用機(jī)制。1 材料與方法1.1 構(gòu)建人肝癌裸鼠模型 BALB/c

9、裸小鼠(中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，40只均為雄性，SPF級(jí)，4 6周齡，體質(zhì)量約1820 g。取人肝癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型LIC-D35 瘤源(復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所瘤源)按照規(guī)范原位接種于裸鼠肝左葉內(nèi)。成瘤率達(dá)100%。隨機(jī)分成4組：對(duì)照組(生理鹽水)、塞來(lái)昔布組、卡培他濱組、聯(lián)合組，每組各10只。1.2 相關(guān)藥物及試劑 塞來(lái)昔布購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司，卡培他濱為瑞士羅氏公司產(chǎn)品，Ki-67試劑盒、TUNEL試劑盒均為DAKO公司產(chǎn)品。Tripure總RNA提取試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、RNA酶抑制劑(均購(gòu)自美國(guó)Promega公司);COX-2引物(上海生物工程公司合成)，上游引物:5-CAG

10、CACTTCACGCATCAGTT-3，下游引物:5-TCTGGTCAATGGAAGCCTGT-3，產(chǎn)物片段長(zhǎng)342 bp。1.3 實(shí)驗(yàn)方法 腫瘤種植術(shù)后5天開(kāi)始治療。對(duì)照組蒸餾水灌胃，每只0.3 ml/d，連續(xù)3周;塞來(lái)昔布組用Celecoxib灌胃，每只25 mg/(kg·d)，連續(xù)3周;卡培他濱組用Capecitabine 1.8 mmol/(kg·d)，連續(xù)3周灌胃、聯(lián)合組Celecoxib和Capecitabine，用藥劑量及給藥途徑與單獨(dú)用藥組相同。實(shí)驗(yàn)第42天用頸椎脫臼法處死所有模型鼠。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、短徑，計(jì)算腫瘤體積(V)，V=長(zhǎng)徑×短徑2

11、/2。腫瘤抑制率=(對(duì)照組體積-實(shí)驗(yàn)組體積)/空白對(duì)照組體積×100%。將標(biāo)本一半放置液氮中保存，一半置于中性福爾馬林中固定。1.4 免疫組織化學(xué)染色 腫瘤組織經(jīng)10%甲醛固定后，石蠟包埋，4 m厚連續(xù)切片。用免疫組化法Ki-67檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖水平、Ki-67 陽(yáng)性為細(xì)胞核染為棕黃或棕褐色，每例切片觀察5 個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)100 個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)，按TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，以細(xì)胞核呈棕黃色顆粒狀為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，在光鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并以AI表示凋亡細(xì)胞的多少，即1

12、00個(gè)完整細(xì)胞中平均凋亡細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示。1.5 RT-PCR 檢測(cè)COX-2 mRNA表達(dá)。(1)總RNA的提?。喊碩ripure試劑說(shuō)明書進(jìn)行。瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm/280 nm的吸收峰值以確定RNA的含量和純度，將RNA調(diào)整至1 g/l。(2)cDNA合成:依次加入MgCl2(25 mmol/L)2 l、dNTPs(各10 mmol/L)1 l，RNAsin(40 U/ml)0.25 l、反轉(zhuǎn)錄酶XL(5 U/m 0.5l 0)、隨機(jī)引物0.5 l，37 溫浴1 h，合成cDNA。(3)PCR反應(yīng):以同一cDNA為模板，在30 l反應(yīng)體系內(nèi)擴(kuò)增COX-2。循環(huán)條件：95 預(yù)變性5 min后，95 50 s，55 1 min，72 1 min，