肌苷對帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護作用

1、肌苷對帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護作用    【關鍵詞】 小鼠 Inosine is neuroprective against MPTPinduced Parkinsons disease in C57BL mice 【Abstract】 AIM: To study the neuroprotective effects of inosine on 1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine（MPTP）induced Parkinsons disease（PD） in C57BL mice. METHODS: The

2、PD models were formed with intraperitoneal injections of MPTP. Inosine was administered intraperitoneally to mice 30 min prior to MPTP. The effects of inosine and MPTP on the behavioral exhibition, the number of dopamine (DA) neurons in the substantia nigra and the density of tyrosine hydroxylaseimm

3、unoreactive (THir) nerve fibers in the striatum, and the level of DA in the striatum were studied by behavioral test, immunohistochemical analysis and fluorospectrophotometry. RESULTS: The scores of locomotion, Rotarod and swim test decreased by about 45 and 43 and 22, respectively. The number of DA

4、 neurons in the substantia nigra declined by about 58, the density of THir nerve fibers also decreased, and the level of DA in the striatum declined by about 88. Inosine, given prior to MPTP, attenuated the effects of MPTP. The scores of locomotion, Rotarod and swim test declined only by about 5 and

5、 11 and 12, respectively, the number of DA neurons in the substantia nigra declined by only about 43 and the level of DA in the striatum declined only by about 71. CONCLUSION: Inosine is neuroprective against MPTPinduced lesions in C57BL mice. 【Keywords】 inosine；1Methyl4pheny1,2,3,6tetrahydropyridin

6、e；Parkinson disease；nearaprotective agents；mice 【摘要】目的： 觀察肌苷對MPTP致帕金森?。≒D）小鼠模型的神經(jīng)保護作用.方法： 用MPTP建立C57BL小鼠PD模型，在MPTP前給予肌苷，通過行為學檢測（自主活動計數(shù)、Rotarod檢測、游泳實驗）、免疫組織化學和熒光分光光度法，觀察肌苷對PD小鼠模型的行為學表現(xiàn)、黑質多巴胺（DA）神經(jīng)元和紋狀體酪氨酸羥化酶免疫反應陽性（THir）神經(jīng)纖維以及紋狀體DA水平的影響.結果： 給予MPTP后，小鼠行為學計數(shù)降低，自主活動計數(shù)、Rotarod檢測、游泳實驗分別降低約45、43和22，黑質DA神經(jīng)元數(shù)

7、目減少約58，紋狀體THir神經(jīng)纖維密度減低，紋狀體DA水平明顯降低約88，提前給予肌苷后降低程度減輕，自主活動計數(shù)、Rotarod檢測、游泳實驗降低程度分別約為5、11和12，黑質DA神經(jīng)元數(shù)目減少約43，紋狀體DA水平降低約71，兩組相比有顯著性差異（P001）.結論： 肌苷對MPTP所致的C57BL小鼠的神經(jīng)損傷具有保護作用. 【關鍵詞】 肌苷；1甲基4苯基1，2，3，6四氫吡啶；帕金森?。簧窠?jīng)保護藥；小鼠 0引言 帕金森?。≒arkinsons disease,PD）是一種臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，是中老年人常見的致殘疾患之一.目前所知，其主要是由于黑質多巴胺（Dopamine,D

8、A）能神經(jīng)元壞死、凋亡，細胞數(shù)目減少，使黑質紋狀體通路DA釋放減少，出現(xiàn)多巴胺乙酰膽堿失衡，患者出現(xiàn)靜止性震顫、肌張力增高、運動減少等一系列癥狀，嚴重影響患者的生活質量.研究顯示PD的發(fā)病與遺傳和環(huán)境等多種因素相關，1甲基4苯基1、2、3、6四氫吡啶（1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine,MPTP）可以導致人類及靈長類、小鼠等多種動物產(chǎn)生PD樣癥狀，為PD研究提供了新的途徑.肌苷（inosine,INO）是腺嘌呤核苷和核苷酸代謝的中間產(chǎn)物之一，臨床上長期作為能量營養(yǎng)劑用于多種疾病如肝臟和心血管疾病的輔助治療.近期研究發(fā)現(xiàn)，肌苷在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與修復中也

9、具有重要的營養(yǎng)和保護作用.本研究利用常用的MPTP致C57BL小鼠PD模型，探討肌苷在PD中的神經(jīng)保護作用. 1材料和方法 11動物和分組8 wk齡雄性C57BL小鼠（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供），體質量2527 g，安靜環(huán)境飼養(yǎng)，自由取食飲水，人工晝夜節(jié)律（1212 h）.將動物隨機分為3組： 生理鹽水組（Saline組）；MPTP組；肌苷 MPTP組（INO MPTP組），每組10只.第13日INO MPTP組給予肌苷60 mg/kg ip 1次/d，Saline組、MPTP組給予等量生理鹽水ip 1次/d，第410日INO MPTP組給予肌苷60 mg/kg ip，30 min后MPT

10、P 30 mg/kg ip 1次/d，MPTP組給予等量生理鹽水ip 30 min后MPTP 30 mg/kg ip 1次/d，Saline組給予等量生理鹽水ip 1次/d. 12試劑和儀器MPTP，INO和DA標準品為Sigma公司產(chǎn)品，小鼠抗酪氨酸羥化酶（TH）單克隆抗體，生物素化兔抗小鼠二抗，ABC試劑盒為Calbiochem公司產(chǎn)品，其余試劑為國產(chǎn)分析純.用001 mol/L鹽酸將DA配制成100 mg/L，保存于02，使用前用001 mol/L鹽酸稀釋配制成標準應用液2 mg/L.酸化正丁醇： 100 mL正丁醇中加入0085 mL濃鹽酸；1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 72

11、）： KH2PO4 035 g和Na2HPO412H2O 145 g溶于975 mL去離子水中，用10 mol/L NaOH或H3PO4調至pH 72，最后定容到100 mL；01 mol/L碘試劑： KI 1 g溶于重蒸餾水后加入I2 025 g，再加重蒸餾水至20 mL，貯于棕色瓶中，避光保存；堿性亞硫酸鈉： 025 g亞硫酸鈉（Na2SO3）溶于5 mol/L NaOH 9 mL中，再加水1 mL混勻，臨用前配制；01 mol/L EDTA溶液（pH 70）： EDTA2Na.2H2O 0371 g溶于95 mL 乙酸鈉（1 mol/L）中，用10 mol/L NaOH調pH 70，最后

12、用乙酸鈉（1 mol/L）溶液加到10 mL，貯存于冰箱備用.UGO BASILE 7750型Rotarod儀，島津RF5000熒光分光光度儀. 13行為學檢測在停藥后第3日，進行下述行為學檢測. 131自主活動計數(shù)參照Kawai H1的測試方法，自制30 cm×30 cm×15 cm的有機玻璃盒，底部刻出6 cm×6 cm的格子，在安靜、光線較暗的環(huán)境中檢測.小鼠適應環(huán)境10 min后，計數(shù)5 min內(nèi)小鼠移動的格子數(shù)，連續(xù)測5次取平均值. 132Rotarod檢測Rotarod實驗需要動物在滾軸上保持平衡并連續(xù)運動，是廣泛采用的檢測運動協(xié)調性的實驗.滾軸直徑6

13、 cm，轉速20 r/min，連續(xù)測20次取平均值. 133游泳實驗參照Donnan GA2的測試方法，將受試小鼠放入一個20 cm×30 cm×20 cm規(guī)格的有機玻璃水箱中，水深10 cm，水溫為2225.評分標準如下： 在1 min內(nèi)能連續(xù)不斷游泳者記30分；大部分時間游泳僅偶爾漂浮者記25分；漂浮時間占整個受試時間 50以上者記20分；偶爾游泳者記15分；偶爾用后肢游動并漂浮在水箱一邊者記10分.檢測5次取平均值.    14黑質及紋狀體免疫組織化學檢測行為學檢測后，每組取5只小鼠行黑質及紋狀體免疫組織化學檢測.5 g/L戊巴

14、比妥鈉1 mL腹腔麻醉后，開胸經(jīng)主動脈先以9 g/L生理鹽水15 mL沖洗血液，再用含40 g/L多聚甲醛的01 mol/L的磷酸緩沖液（PBS，pH 72）100 mL先快后慢灌注固定1 h灌畢立即取腦，在含300 g/L蔗糖的PBS內(nèi)過夜（4 ）至組織沉底.參考小鼠腦圖譜，在恒冷箱（22）行中腦黑質和紋狀體冠狀切片，片厚30 m，收集于001 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS, pH 72）內(nèi).免疫組織化學染色步驟如下： 3 mL/L過氧化氫甲醇溶液（300 mL過氧化氫1 mL 甲醇80 mL PBS 19 mL）30 min，3 g/LTriton X100的PBS 30 min，浸入小

15、鼠抗TH單克隆抗體（13000）孵育48 h（4），浸入生物素化兔抗小鼠二抗（1500）孵育2 h（室溫），浸入ABC復合物（1500）孵育2 h（室溫），蒸餾水快速沖洗后硫酸鎳胺加強DAB藍色反應法顯色2030 min，當陽性產(chǎn)物呈深藍色而背底清晰時蒸餾水沖洗3次終止顯色.以上步驟每步后均需001 mol/L PBS清洗3次，每次10 min.其中一抗用含10 mL/L小牛血清和3 g/L的Triton X100的PBS稀釋，二抗和ABC復合物用PBS稀釋.貼片，脫水，透明，中性樹膠封片.每只小鼠黑質取頭端、中部、尾端切片3張，取大腦腳中點上方區(qū)域，在200×高倍鏡下計數(shù)TH免疫反

16、應陽性（THir）神經(jīng)元個數(shù)，取平均數(shù). 15紋狀體DA水平檢測在行為學檢測后，每組取5只行紋狀體DA水平熒光分光光度法檢測.將小鼠迅速斷頭、取腦，放入預冷的生理鹽水中，去除腦膜和血液，濾紙吸干水分，在冰皿上剝離紋狀體，稱質量后置于含有少量冰冷的酸化正丁醇的勻漿器中，在冰水浴中制成勻漿，轉移至具塞刻度離心管內(nèi)，并用酸化正丁醇補充至3 mL，按以下步驟測DA濃度： 勻漿液振蕩1 min，離心（2500 r/min）5 min，上清液15 mL 1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 72）15 mL，振蕩1 min，離心5 min，水相05 mL EDTA溶液04 mL混合，加碘試劑02 mL混

17、合、靜置，準確反應2 min，加堿性亞硫酸鈉05 mL混合、靜置，準確反應2 min，加6 mol/L乙酸06 mL，沸水浴20 min，冷卻后檢測熒光強度（波長： 激發(fā)光320 nm，發(fā)射光370 nm）.每批實驗均需空白管和標準管.空白管： 取001 mol/L鹽酸02 mL，用酸化正丁醇補充至3 mL，其余操作同樣品管.標準管： 取標準應用液02 mL，用酸化正丁醇補充至3 mL，其余操作同樣品管. 統(tǒng)計學處理： 實驗結果采用x±s表示，SPSS100統(tǒng)計軟件行單因素方差分析和SNKq組間兩兩比較，P005為有統(tǒng)計學意義. 2結果 21小鼠給予MPTP后的一般表現(xiàn)小鼠在給予MP

18、TP后35 min，出現(xiàn)震顫、運動減少、弓背、后肢張開、步態(tài)不穩(wěn)、豎尾、豎毛等改變，個別出現(xiàn)癲癇樣發(fā)作，約3060 min后上述癥狀逐漸減輕，24 h后基本恢復正常，但隨著給藥次數(shù)的增加，急性反應表現(xiàn)反倒減輕，但24 h后其運動減少、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、反應遲緩的表現(xiàn)越來越明顯. 22行為學檢測結果見Tab 1,MPTP組出現(xiàn)小鼠行為學計數(shù)降低，自主活動計數(shù)、Rotarod檢測、游泳實驗分別降低約45、43和22，提前給予肌苷的INO MPTP組降低程度減輕，自主活動計數(shù)、Rotarod檢測、游泳實驗降低程度分別約為5、11和12，與MPTP組相比，自主活動計數(shù)和Rotarod檢測（P001)

19、以及游泳實驗（P005）具有顯著性差異.    表1MPTP和肌苷對小鼠行為學的影響略 圖1Saline,MPTP和INO MPTP組小鼠的黑質THir神經(jīng)元數(shù)目略 圖2Saline組、MPTP組和INO MPTP組小鼠的黑質THir神經(jīng)元及紋狀體THir神經(jīng)纖維略 23黑質及紋狀體免疫組織化學檢測結果見Fig 1，2.MPTP組與Saline組相比，黑質THir神經(jīng)元數(shù)目明顯減少約58，殘留神經(jīng)元皺縮，突起減少或消失，紋狀體THir神經(jīng)纖維密度減低，提前給予肌苷后黑質THir神經(jīng)元數(shù)目減少約43，與MPTP組相比有顯著性差異（P001）. 24紋狀體D

20、A水平檢測結果見Fig 3.MPTP組與Saline組相比，紋狀體DA水平明顯降低約88，而INO MPTP組提前給予肌苷后降低程度約為71，與MPTP組相比有顯著性差異（P001）. 圖3Saline，MPTP和INO MPTP組小鼠的紋狀體DA水平略 3討論 MPTP的神經(jīng)毒性作用發(fā)現(xiàn)于20世紀80年代，它能導致人類及多種動物出現(xiàn)PD樣癥狀.MPTP進入細胞內(nèi)以后，被位于線粒體外膜的單胺氧化酶B催化生成甲基苯基吡啶離子（MPP ），釋放到細胞外間隙，被臨近的DA能神經(jīng)元軸突末梢通過突觸前膜DA轉運體攝取，并逆向運輸至神經(jīng)元胞體，被線粒體主動攝取而濃集，特異性抑制氧化呼吸鏈復合體I和電子傳遞

21、，減少ATP生成，造成DA能神經(jīng)元ATP耗竭，并且通過促進反應氧族和過量一氧化氮的生成而發(fā)揮毒性作用，對DA能神經(jīng)元造成選擇性的損傷而出現(xiàn)壞死和凋亡.MPTP的神經(jīng)毒性作用已在多種動物中得到證實，包括靈長類、小鼠、大鼠、貓、豬和金魚等.在接受MPTP的小鼠和靈長類腦內(nèi)黑質DA能神經(jīng)元大量死亡，紋狀體TH陽性纖維大量喪失，紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA水平均明顯降低，也有黑質紋狀體小膠質細胞和星形細胞的增生和藍斑、下丘腦等區(qū)的損傷，與PD患者的改變基本相同.MPTP對C57BL小鼠作用明確，是目前最常用的PD動物模型之一. 肌苷是臨床常用的能量營養(yǎng)劑，在體內(nèi)肌苷的生成有兩條途徑： 腺嘌

22、呤核苷酸在腺苷酸酶的催化下生成腺苷，腺苷在腺苷脫氨酶作用下生成肌苷；或者腺嘌呤核苷酸在嘌呤脫氨酶催化下生成次黃嘌呤核苷酸，再經(jīng)核苷酸酶去磷酸并加一分子水后生成肌苷.肌苷的分解則通過核苷磷酸化酶生成次黃嘌呤和1磷酸核糖，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶催化下經(jīng)黃嘌呤生成代謝終產(chǎn)物尿酸.1磷酸核糖在磷酸核糖變位酶的作用下轉變?yōu)?磷酸核糖，其在磷酸核糖焦磷酸合成酶催化下生成磷酸核糖焦磷酸（PRPP），PRPP參加嘌呤核苷酸的從頭合成途徑；次黃嘌呤則與PRPP生成次黃嘌呤核苷酸，參加嘌呤核苷酸的補救合成途徑.生成5磷酸核糖后，還可以通過磷酸戊糖通路在無氧糖酵解時產(chǎn)生ATP（3分子肌苷可產(chǎn)生8個分子的ATP），由

23、此肌苷可以參加ATP的生成和其他腺嘌呤核苷酸的代謝過程. 研究發(fā)現(xiàn)，肌苷不僅僅增加ATP生成，參加能量代謝，而且在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復中也具有重要的營養(yǎng)和調節(jié)作用.Litsky ML等使用魚藤酮抑制呼吸鏈，對培養(yǎng)的鼠胚脊髓細胞進行損傷，當給予肌苷后發(fā)現(xiàn)明顯提高神經(jīng)元的存活率和正常形態(tài)細胞比例，并表現(xiàn)出濃度依賴性 3.肌苷對硫酸鋅誘導的體外培養(yǎng)PC12細胞的損傷也可以增加細胞存活率，維持細胞正常形態(tài)，具有直接的保護作用 4.除了對神經(jīng)元的直接保護作用之外，肌苷還可以促進神經(jīng)突起的生長，恢復神經(jīng)突觸的功能.Benowitz LI等人發(fā)現(xiàn)肌苷可促進體外培養(yǎng)的金魚和幼鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突的生長，伴有

24、促進軸突再生相關基因如生長相關蛋白GAP43，E587Ag，Neurolin，細胞黏附分子L1和T1的表達5，6.在體內(nèi)實驗中，將成年大鼠錐體交叉平面以上的一側皮質脊髓束切斷，于對側大腦皮質感覺運動區(qū)用微泵將肌苷持續(xù)注入，結果發(fā)現(xiàn)未損傷側皮質錐體細胞的軸突側支大量出芽，并生長到損傷側已潰變的頸髓白質中，形成新的突觸和神經(jīng)通路，免疫組織化學證明損傷區(qū)有大量的GAP43蛋白表達7.同樣，在阻斷一側大腦中動脈的大鼠半側腦皮層缺血模型，通過微泵將肌苷持續(xù)注入枕大池或者側腦室，結果發(fā)現(xiàn)與Saline組相比，雖然梗死區(qū)域大小無差別，但未損傷側皮質紅核束和皮質脊髓束均有明顯的再生軸突側支生長進入損傷側，伴有

25、高水平的GAP43蛋白表達，同時觀察到大鼠癱瘓側上肢運動功能有明顯恢復8.最近研究表明，在成年大鼠視神經(jīng)橫斷以及移植自體外周神經(jīng)，給予ip肌苷，則軸突切斷的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活數(shù)增加，以及在移植的外周神經(jīng)內(nèi)出現(xiàn)明顯增加的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞再生軸突9，10.    本研究結果顯示，肌苷對MPTP致帕金森病小鼠模型也具有神經(jīng)保護作用.肌苷的作用可能通過以下機制： 增加ATP的生成，減輕MPTP抑制線粒體呼吸鏈后造成的能量耗竭，提高黑質DA神經(jīng)元存活率； 肌苷可能通過抑制核蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）從而減少受損細胞內(nèi)ATP的消耗，防止能量耗竭，同時P

26、ARP的活性被肌苷抑制后還可阻止一氧化氮合酶的作用過程，減少一氧化氮合成，結果使過亞硝酸鹽生成減少，保護細胞的膜性結構，減輕MPTP的神經(jīng)毒性4； 肌苷可以升高神經(jīng)元內(nèi)Bcl2水平，而Bcl2可抑制MPTP誘導的神經(jīng)元凋亡，阻止細胞的壞死過程4. 肌苷降解形成尿酸，而尿酸可以保護神經(jīng)元防止缺氧損傷，清除過亞硝酸鹽和氧自由基11，12； 肌苷可以通過細胞膜易化擴散進入神經(jīng)元內(nèi)，促進神經(jīng)細胞突起的生長，恢復損傷的突觸功能，可能的機制包括激活胞內(nèi)的蛋白激酶N；催化生成cAMP，cAMP作為第二信使參與神經(jīng)突起的生長；抑制多種抑制性因子，如激動Gi蛋白的髓鞘相關糖蛋白等，從而促進細胞突起的生長，保留殘

27、存神經(jīng)元的突觸功能4，5.本研究中提前給予肌苷后，MPTP對C57BL小鼠黑質DA能神經(jīng)元的損傷減輕，紋狀體的THir神經(jīng)纖維得以保存，紋狀體DA濃度降低程度減輕，是行為學檢測反映的PD癥狀較輕的病理基礎.通過本研究證實了肌苷對MPTP致帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護作用，為肌苷應用于帕金森病的預防提供了實驗依據(jù)，為進一步深入研究神經(jīng)組織保護機制和治療帕金森病奠定了基礎. 【參考文獻】 1 Kawai H, Makino Y, Hirobe M, et al. Novel endogenous 1,2,3,4tetrahydroisoquinoline derivatives: Uptake by

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