補陽還五湯藥浴對大鼠周圍神經(jīng)損傷再生影響的實驗研究

1、補陽還五湯藥浴對大鼠周圍神經(jīng)損傷再生影響的實驗研究        【摘要】  目的研究補陽還五湯藥浴對周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)的作用。方法采用雌性Wistar大鼠90只， A組為補陽還五湯藥浴組，B組為補陽還五湯口服組，C組為單純端端縫合組，每組30只。造模采用大鼠坐骨神經(jīng)橫斷損傷模型，造模成功后7 d起，A組大鼠放入補陽還五湯溫?zé)崴幰褐杏斡荆羧?次，5 min/次； B組用補陽還五湯制劑灌胃，隔日1次，3 ml/次；C組大鼠進行單純端端縫合。3組均于術(shù)后6周取材進行電生、組織形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果補陽還五湯藥浴可

2、以明顯減少神經(jīng)損傷后運動神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元的死亡，防止支配肌肉的萎縮變性，促進損傷后功能的恢復(fù)。結(jié)論補陽還五湯藥浴可以在神經(jīng)元、損傷局部、終末效應(yīng)器多個平面、多個角度對神經(jīng)修復(fù)產(chǎn)生積極作用。 【關(guān)鍵詞】  周圍神經(jīng)；損傷與再生；補陽還五湯；藥浴Abstract：ObjectiveTo study the effect of Buyang Huanwu Decoction medicated bath on neurogenesis after the peripheral nerve injury.Methods90 wistar rats were randomly divided

3、 into 3 groups, group A was Buyang Huanwu Decoction medicated bath ,group B was Buyang Huanwu Decoction administration, group C simply had an end-to-end sutured operation serve as control. The model of ischiadic nerve transsection were adopted. After 7 days, wistar rats of group A  swam in the

4、warm Buyang Huanwu Decoction physic liquor, 5 minutes a time every other day. The intragastric administration was given in group B 3 ml a time every other day. Group C simply had an end-to-end sutured operation. Electrophysiology and histomorphology were detected after 6 weeks. ResultsThe Buyang Hua

5、nwu Decoction medicated bath could obviously reduce the death number of motor neurons and sensory neurons after nerve injury, prevent the atrophy and degeneration of gastrocnemius muscle and promote the functional recovery after injury. ConclusionThe Buyang Huanwu Decoction medicated bath may play a

6、n active role in the nerve repair of neuron, damage region and ending effective apparatus from multiple facts.Key words：Peripheral nerve;  Injury and restore;  Buyang Huanwu Decoction；  Medicated bath    周圍神經(jīng)損傷屬于細胞損傷的范疇1，其再生的基礎(chǔ)和臨床研究雖取得了長足的進步，但目前周圍神經(jīng)損傷修復(fù)后功能恢復(fù)仍欠理想。究其原因，對于

7、每一條神經(jīng)纖維來說，神經(jīng)元、神經(jīng)干中的支持細胞及其終末器官是互相營養(yǎng)的。周圍神經(jīng)干損傷后，其上位神經(jīng)元、整個神經(jīng)干及終末器官均會發(fā)生變性甚至壞死。所以，周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)也是一個綜合的修復(fù)過程。近年來，中醫(yī)中藥以其多靶點、多途徑的綜合療效優(yōu)勢2愈來愈受到人們的重視。神經(jīng)損傷屬于中醫(yī)的“痿證”，表現(xiàn)為肢體功能障礙，肌肉萎縮，感覺消失，上應(yīng)補氣活血通絡(luò)，補陽還五湯在臨床治療和我們的前期研究中有良好的作用。因此，我們設(shè)計了動物實驗來進一步研究補陽還五湯藥浴及口服對周圍神經(jīng)再生的影響。1  材料與方法1.1 材料實驗于2006-03-07在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心完成。雌性Wistar大鼠，

8、90只，體重220250 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。中藥煎劑: 生黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍6 g，川芎3 g，紅花3 g，地龍3 g，桃仁3 g。方藥組成采用補陽還五湯原方，5倍劑量為1劑?；旌暇鶆颍逯笄邦A(yù)先用清水浸泡20 min，加水量約5 000 ml，煮沸后文火再煎約20 min，煎得劑量約3 0003 500 ml，冷卻至微溫，進行灌胃或藥浴。中藥材及煎制均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一煎藥室提供。1.2  方法按手術(shù)先后順序隨機分成A、B、C 3組，A組為補陽還五湯藥浴組，B組為補陽還五湯口服組。C組為單純端端縫合組，每組30只。造模采用大鼠坐骨神經(jīng)橫斷

9、損傷模型：右坐骨神經(jīng)于坐骨結(jié)節(jié)下0.5 cm水平橫行切斷，用9/0無創(chuàng)尼龍縫合線均勻縫合神經(jīng)外膜3針。造模成功后7 d起，A組大鼠放入補陽還五湯溫?zé)崴幰褐杏斡?，隔?次，5 min/次；B組用補陽還五湯制劑灌胃，隔日1次，3 ml/次；C組大鼠進行單純端端縫合。3組均于術(shù)后6周取材進行電生理學(xué)、組織形態(tài)學(xué)觀察。1.2.1  坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）測定自制大鼠行走箱。術(shù)后3周起，隔日進行SFI測定。碳素墨水刷染大鼠雙后足，放在底面鋪設(shè)白紙的行走箱通道上行走，可清晰記錄大鼠行走過程中雙側(cè)后足足印78個，選取質(zhì)量較好的正常側(cè)足和實驗側(cè)足測定各變量，將數(shù)值代入Bain公式3SFI。1.2

10、.2  神經(jīng)傳導(dǎo)速度（NCV）測定術(shù)后6周各組隨機取15只大鼠，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，切取術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)全長，采用Pclab生物信號采集處理系統(tǒng)（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生理教研室提供）記錄誘發(fā)電位并計算出坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（NCV）。1.2.3  組織形態(tài)學(xué)觀察L4,L5段脊髓及背根神經(jīng)節(jié)術(shù)后6周各組取15只大鼠，麻醉后經(jīng)左心室向升主動脈插管后，灌入洗滌液(生理鹽水200 ml，肝素鈉4 mg, 鹽酸普魯卡因1.0 g)后， 4%多聚甲醛300 ml心臟灌注固定，取脊髓L4L5段和雙側(cè)L4，L5脊神經(jīng)節(jié)置于4%多聚甲醛液中固定2 d后，進行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚6 m。石蠟切

11、片脫蠟，切片入1%焦油紫染液，37溫箱中浸染1 h后，蒸餾水速洗，95%乙醇迅速分化，鏡檢尼氏體呈紫色，其他組織幾乎無色，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。應(yīng)用美國Image-pro plus專業(yè)圖像分析系統(tǒng)進行觀察，每張切片隨機抽取5個同倍率視野，進行圖像分析。    神經(jīng)損傷局部：實驗側(cè)坐骨神經(jīng)測定NCV后，距吻合口近遠端各0.5cm處橫行切斷坐骨神經(jīng)，常規(guī)HE染色，并應(yīng)用美國Image-pro plus專業(yè)圖像分析系統(tǒng)進行觀察及分析。    失神經(jīng)支配腓腸?。焊鹘M大鼠麻醉狀態(tài)下取大鼠雙側(cè)腓腸肌，稱濕重后取中份肌組織作常規(guī)H

12、E染色，切片同樣應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行觀察及分析。1.2.4  主要觀察指標SFI，NCV及組織形態(tài)學(xué)觀察。1.2.5  統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)采用±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均在SPSS11.0軟件中進行，采用方差分析，多組間兩兩比較用LSD法。1         2  結(jié)果2.1  坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）各組變量代入Bain公式SFI數(shù)值，所得結(jié)果以周為單位進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)表明：補陽還五湯藥浴組明顯優(yōu)于口服組，口服組明顯優(yōu)于單純端端縫合組。結(jié)果見表1。表1 

13、3組SFI比較（略）2.2  神經(jīng)傳導(dǎo)速度（NCV)實驗測得A組6周時NCV值為(18.2±5.1)m/s，B組為(17.6±4.8)m/s, C組為(12.5±4.7)m/s。數(shù)據(jù)表明：補陽還五湯藥浴組和口服組均明顯優(yōu)于單純端端縫合組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。但藥浴組和口服組未見明顯差異（P>0.05）。2.3  組織形態(tài)學(xué)變化2.3.1  L4,L5段脊髓及背根神經(jīng)節(jié)A組表現(xiàn)為脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)目減少，部分神經(jīng)元輪廓不清，神經(jīng)元尼氏體欠清晰，脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元的染色灰度和大小形態(tài)改變不大；B組表現(xiàn)為前角運動

14、神經(jīng)元數(shù)量較A組減少，較多神經(jīng)元輪廓不清，尼氏體模糊，脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)變化介于A，C兩組之間；C組表現(xiàn)為前角運動神經(jīng)元數(shù)目顯著減少，神經(jīng)元輪廓不清，細胞體積變小，分布分散，尼氏體模糊不清，脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則。各組神經(jīng)元數(shù)目見表2。表2  術(shù)后6周各組脊髓前角運動神經(jīng)元及脊神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元數(shù)目比較（略）2.3.2  坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)改變A組表現(xiàn)為神經(jīng)纖維趨于成熟，可見規(guī)則的接近正常的迂回波浪狀排列通過吻合口；B組表現(xiàn)為神經(jīng)纖維走行欠規(guī)則，可見纖維纏結(jié)，間質(zhì)膠原增生；C組表現(xiàn)為神經(jīng)纖維走行紊亂，與間質(zhì)膠原纖維相互纏繞交結(jié)，間質(zhì)大量膠原纖維增生，將新生的神經(jīng)纖維包繞

15、分解。2.3.3  腓腸肌形態(tài)學(xué)結(jié)果A組表現(xiàn)為肌纖維略減少，形態(tài)較規(guī)則，結(jié)構(gòu)尚清晰，染色較均一，大部分肌細胞核仍緊貼于肌纖維的周邊，肌纖維腫脹與空泡樣變性不明顯，可見結(jié)締組織增生，細胞間隙增寬，肌纖維輕度萎縮；B組表現(xiàn)為肌纖維較A組減少，形態(tài)不規(guī)則，部分結(jié)構(gòu)紊亂，可見肌纖維變性，結(jié)締組織增生，細胞間隙增寬，肌纖維萎縮較明顯；C組表現(xiàn)為肌纖維顯著減少，且形態(tài)不規(guī)則，大小不一，結(jié)構(gòu)紊亂，皺縮明顯，有些肌纖維腫脹變性伴有空泡，細胞核體積明顯增大，分布在肌纖維邊緣，部分核向肌纖維內(nèi)遷移，細胞間隙明顯增寬，結(jié)締組織明顯增生，肌纖維萎縮明顯。3  討論   

16、; 補陽還五湯之傳統(tǒng)醫(yī)方出自清代名醫(yī)王清任所著醫(yī)林改錯，是多種原因引起的癱瘓、肢體痿軟等病癥的著名組方。研究表明補陽還五湯能改善血液流變性，抑制血小板聚集，減少微血栓發(fā)生，促進毛細血管的生長，改善損傷處神經(jīng)的微循環(huán)，促進氧和能量代謝，使神經(jīng)組織得到較多的血液和氧氣，使有氧代謝順利進行4。藥浴療法是以中醫(yī)基本理論為指導(dǎo)原則，用中藥煎湯洗浴患者的局部或全身，利用藥物和水的特性，達到防治疾病目的的一種外治療法，因此其治療仍以辨證論治為原則，正如清代醫(yī)家吳師機指出“外治之理即內(nèi)治之理”。所以，從根本上來說，藥浴療法與內(nèi)服法在作用機制上是相似的。藥浴療法不僅具有水療的作用，還具有中藥對機體產(chǎn)生醫(yī)療效能的

17、優(yōu)勢, 通過透皮作用使藥物有效成分通過局部進入體內(nèi)，直達病所，既避免了藥物的損耗，又提高了藥物的利用度，達到治療或輔助治療的目的5。    周圍神經(jīng)損傷屬于中醫(yī)“痿證”范疇，表現(xiàn)為肢體功能障礙，肌肉萎縮，感覺消失，治療上應(yīng)補氣活血通絡(luò)。周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)是一個綜合的過程。需要盡量減少神經(jīng)元的死亡、需要加快對瓦勒變性壞死組織碎片的清除、需要較強的趨化作用引導(dǎo)感覺、運動神經(jīng)纖維正確長入相應(yīng)效應(yīng)器、需要延緩效應(yīng)器的萎縮，所以行之有效的修復(fù)方法應(yīng)該是對損傷全方位的修復(fù)。本實驗結(jié)果表明，補陽還五湯藥浴能減少神經(jīng)損傷后的運動和感覺神經(jīng)元死亡，維持神經(jīng)元正常的結(jié)構(gòu)和功能，還能促進再生神經(jīng)纖維長入遠斷端，減少與間質(zhì)膠原纖維的相互纏繞，減少肌纖維的變性，抑制結(jié)締組織增生，減輕肌肉萎縮。補陽還五湯藥浴促進周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)，體現(xiàn)了中醫(yī)藥多靶點、多途徑的療效優(yōu)勢。關(guān)于其作用的機理，我們認為主要是增加了局部營養(yǎng)，促進了微循環(huán)的建立，改善了再生微環(huán)境，至于其作用機制，我們將會進一步研究。【】  1顧立強,裴國獻.周圍神經(jīng)損傷基礎(chǔ)與臨床,第1版M.北京:人民軍醫(yī)出版社,2001：1.2王亞軍.中藥促周圍神經(jīng)再生的實驗研究集釋J.中醫(yī)藥學(xué)刊,2