藻類葉綠素熒光技術(shù)

1、藻類葉綠素熒光測量技術(shù)Measuri ng Algae自從上世紀六十年代Carl Lorenzen （1966）首次將海水泵入安裝在考祭船上的葉綠素 熒光儀進行藻類研究以來，葉綠素熒光技術(shù)很快成為海洋湖泊藻類研究的重要技術(shù)手段。特別是上世紀九十年代以來，Kolber等（1993,1998 ）、Trtilek 等（1997）、Nedbal等（1999）、Dijkman 等（1999） > Koblizek 等（1999）等科學家采用 P&F技術(shù)“ pump-and-probe ”、 雙調(diào)制技術(shù)（Dual-modulation ）、FRR技術(shù)（fast repetition rate

2、、等對海洋湖泊藻類進行了大量研究，奠定了葉綠素熒光技術(shù)在藻類研究監(jiān)測中的重要地位。下面就一系列國 際先進的用于藻類研究監(jiān)測的葉綠素熒光儀器技術(shù)做一簡單介紹，進一步的信息及參考文 獻等可咨詢Ecolab實驗室（，）。0,4100 200Time sd九2柵藻（Seenedesmu） FKM葉綠素熒光成像及不同柵藻的葉綠素熒光動態(tài)曲線1. FL3500葉綠素熒光儀1995年Trtilek等研制生產(chǎn)了世界上首款 FL100雙調(diào)制葉綠素熒光儀（Trtilek等，1997； Koblizek 等，1997; Nedbal 等，1999）,時間分辨率可達 1卩 s。FL3500 歷經(jīng) FL100、FL20

3、0 等幾次升級換代，是世界上時間分辨率最高、功能最為強大、配置靈活多樣的葉綠素熒光 技術(shù)儀器，由控制單元（主機）和功能多樣化的測量單元組成，其主要功能特點為：1）通用455nm和625nm藍光和橙紅光雙色光源，滿足所有藻類葉綠素熒光激發(fā)測量；2）雙色調(diào)制測量光、雙色調(diào)制光化學光和雙色持續(xù)光化學光；3）除通用藍光和橙紅光雙激發(fā)光測量單元外，還可選配其它波長的測量單元， 組成2個以上多激發(fā)光葉綠素熒光系統(tǒng)；4）既可進行PAM（脈沖調(diào)制）測量，還可進行STF單周轉(zhuǎn)光閃、TTF雙周轉(zhuǎn)光閃、MTF 多周轉(zhuǎn)光閃及 FRR程序測量，測量程序（protocols ）包括單光閃熒光誘導(dǎo)、 OJIP-test、Q

4、A再氧化動力學、放氧復(fù)合體 S狀態(tài)轉(zhuǎn)換等；5）可選配時間分辨率為4卩s的標配測量單元或時間分辨率達 1卩s的快速測量單元， 還可選配水下原位葉綠素熒光測量單元及葉夾式測量單元，從而組成功能強大多樣化的葉綠素熒光測量系統(tǒng)，既可測量水體微藻葉綠素熒光，還可原位測量水下 大型藻類及珊瑚礁藻類葉綠素熒光，及高等植物葉片葉綠素熒光動態(tài)；6）雙通道主機系統(tǒng)（控制單元），可選配雙檢測器，同時測量藻類葉綠素及細菌葉 綠素熒光動態(tài)；或選配溶解氧測量探頭，同步測量溶解氧動態(tài)；7）可客戶定制高靈敏度測量單元，檢測極限達1ngChl/L ；8）可對溫度進行0 70° C調(diào)控，精度達0.1° Co2

5、. FL5000雙通道超高靈敏度葉綠素熒光儀FL5000為雙通道雙檢測器，可同時測量藻類葉綠素和細菌葉綠素，是目前世界上靈敏 度最高的葉綠素熒光測量儀，測量極限可達0.1 ng Chl/L，適于藻類濃度很低的海洋、泉水等進行就地（in situ ）測量監(jiān)測，可自動運行PAM測量、葉綠素熒光誘導(dǎo)、OJIP-test、 QA再氧化動力學、放氧復(fù)合體 S狀態(tài) 轉(zhuǎn)換、熒光淬滅分析等。儀器內(nèi)置以太 網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，可進行遠程控制和數(shù)據(jù) 瀏覽下載等。其主要功能特點如下：1）超高靈敏度，可用于海洋及自 然水體浮游植物包括藻類及 光氧細菌的對比研究分析；2）便攜性強、使用方便，控制單 元、測量單元等集成在一個機

6、 箱內(nèi)，水樣可通過蠕動泵自動 控制抽樣測量，既可用于實驗 室測量研究，又可用于野外或在考察船上進行測量或監(jiān)測；3）雙通道雙檢測器，可同時測量藻類葉綠素熒光動態(tài)和細菌葉綠素熒光動態(tài)（如藍 藻細菌與藻類），內(nèi)置精密時鐘測量數(shù)據(jù)帶時間戳；4）內(nèi)置以太網(wǎng)接口和 WIFI，可實現(xiàn)遠程遙控和數(shù)據(jù)采集，具觸摸屏5）具備FL3500的光源雙調(diào)制功能，雙色調(diào)制測量光、雙色調(diào)制光化學光及持續(xù)光化 學光6）具備PC遙控模式和觸摸屏在線模式，觸摸屏界面有圖表（Graph）、數(shù)據(jù)（Numerics）、 設(shè)置（Sett in gs ）、WiFi、記錄（Record）及分析（An alysis ）等菜單或按鍵， 用于設(shè)置光

7、源等參數(shù)、實施在線測量、無線網(wǎng)絡(luò)連接、蠕動泵控制、即時顯示數(shù) 據(jù)或圖及記錄分析等功能3. Aquapen手持式藻類熒光儀Aquapen水體藻類熒光儀是目前世界上便攜性最強（僅手機大?。?、功能最強大、靈敏 度最高的手持式水體藻類熒光測量設(shè)備，有探頭式和試管式兩種，探頭式可直接將測量探 頭插入水體中原位測量，試管式可采樣在試管（比色皿） 中測量。Aquapen不僅具備PAMM量技術(shù)的所有功能，還可 進行OJIP-test測量并自動分析出26個OJIP測量參數(shù)， 其中OJIP固定面積與藻類濃度相關(guān)。Aquapen具體功能特 點如下：1）高靈敏度，測量極限為0.5卩gChl/L2）具備NPQ1和NPQ

8、2雙程序熒光淬滅分析和三套給 光程序的光響應(yīng)曲線測量3）可設(shè)置測量程序和測量間隔后進行自動測量紀錄4）探頭式標配為藍色激發(fā)光，可選配橙紅色、白色或其它波長的激發(fā)光；試管式具備藍光和橙紅光雙色測量光源，紅色光源適于藍 藻測量，藍色光源適于綠藻等5）試管式還可測量兩個波段的光密度值 OD680和 OD7206）可選配2個或2個以上不同激發(fā)光的Aquapen已滿足多激發(fā)光測量的需求7）FluorPen數(shù)據(jù)分析軟件可顯示數(shù)據(jù)圖表包括原始測量數(shù)據(jù)和分析數(shù)據(jù)、熒光動態(tài) 曲線等8）內(nèi)置數(shù)據(jù)采集器可采集紀錄100000個帶時間戳的數(shù)據(jù)4. FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)FKM（ Fluoresce nee

9、Ki netic Microscope ）多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)是目前功能最為強大的藻類及植物顯微熒光光譜研究儀器，由包含可擴展平臺的增強型蔡司顯微鏡、 高分辨率CCD相機、多光譜激發(fā)光源組、高解析度光譜儀、控溫模塊、熒光成像模塊、專 用藻類熒光成像觀測室以及相應(yīng)的控制單元和專用的工作站與分析軟件組成。多光譜激發(fā) 光源組包括紫外光、紅光、蘭光、綠光和白色光源。FKM不僅可以進行微藻、單個細胞、 單個葉綠體甚至基粒-基質(zhì)類囊體片段進行Fv/Fm Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅、OJIP快 速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等各種熒光成像動力學分析，還能通過激發(fā)光源組及光譜儀系 統(tǒng)進行任意熒光激發(fā)和

10、熒光釋放波段的測量與光譜分析。除對葉綠素熒光動態(tài)進行成像光 譜分析外，還可對靜態(tài)熒光如 GFP熒光、DAPI熒光、DiBAC4熒光、SYTOX錄色熒光、CTC 熒光染色等熒光蛋白、熒光素進行成像分析，并可通過光譜儀對各種熒光進行光譜分析， 區(qū)分各發(fā)色團（例如，PSI和PSII及各種捕光色素復(fù)合體等）并進行深入研究。目前中科 院植物所、海洋所都配備了 FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)，詳細信息請咨詢Ecolab實 驗室。其它用于藻類研究的葉綠素熒光成像系統(tǒng)還有FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀、FluorCam圭寸閉式葉綠素熒光成像系統(tǒng)、FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統(tǒng)等。下圖為絲狀

11、魚腥藻FKM成像分析：A為沿藻絲從左到右不同細胞的 Fm成像，其中第7 和第17個細胞已分化形成異形胞；B為從左到右每個細胞的Fo值，C為Fv值，D為Fv/Fm（源自 Ferimazova 等，2013，Photosynthesis Research ， 116:79-91 ）。5. AOM廣譜藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)AOM（Algal On-line Monitor ）為高靈敏度廣譜藻類監(jiān)測儀器，適于監(jiān)測綠藻、藍藻、硅藻等各種浮游生物，靈敏度達 30ngChl/L （綠藻檢測 極限達10cell/ml ;藍藻檢測極限100cell/ml ），應(yīng)用 于自然水體如水華爆發(fā)早期監(jiān)測預(yù)警等，及人工水體藻類短

12、期或長期監(jiān)測如水處理監(jiān)測控制等，還可與FFL-40、 MicroMac1000營養(yǎng)鹽在線監(jiān)測儀組成富營養(yǎng)化監(jiān)測系 統(tǒng)。AOME置藍色和紅色（或選配 590nm黃色光源）雙 色測量光，監(jiān)測參數(shù)包括 Ft、QY OJIP等，其中Ft、 OJIP固定面積可反映藻類濃度動態(tài)，QY可反映藻類生 理狀態(tài)如受脅迫狀態(tài)、水體毒性或突發(fā)污染事件等。內(nèi) 置數(shù)據(jù)采集器，可存儲紀錄100000個數(shù)據(jù)或300次OJIP 測量數(shù)據(jù)。通過蠕動泵自動抽樣，可通過GPRS無線數(shù)據(jù)傳輸6. FFL-40 FRRF藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)FFL-40為運行FRF測量程序的藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)，由FFL-40主機和PC操作系統(tǒng)組成。 FRRF熒

13、光儀廣泛用于浮游植物生產(chǎn)力估算和模型模擬分析等。通過FRR自動測量，F(xiàn)FL-40可以測量 PSII 功能吸收截面積（T PSII （functional absorption cross-section of PSII ）、PSII能量傳遞p、Fo、Fo'、Fm Fm等，并進而實時估算光合電子傳遞速度 Pe快速光響 應(yīng)曲線RLC等。FFL-40技術(shù)特點如下：1）PC操作系統(tǒng)具備多平臺網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器功能，可通過GUI遠程控制測量過程和數(shù)據(jù)通訊，可同時操作多臺FFL-40;2）450nm和590nm雙色測量光源和光化學光 源，590nm光源強度可達60000卩mol/m2s, 450nm藍光強

14、度可達120000卩mol/m2s;3）單周轉(zhuǎn)誘導(dǎo)與弛豫相時間分辨率可達1.5卩s ；4）可通過NTP服務(wù)器程序支持與其它設(shè)備的 同步化監(jiān)測，如同步化GPS定位（特別適 用于儀器安裝在考察船進行移動式監(jiān)測（參見圖），可監(jiān)測紀錄浮游植物時空分 布格局）5）內(nèi)置光適用和暗適應(yīng)室，通過泵閥自動抽樣、6）特別適用于浮游植物生產(chǎn)力評估；自動清洗;7）檢測靈敏度達0.5卩gChl/L7. FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)（光養(yǎng)生物反應(yīng)器）FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)將藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測儀器獨特地結(jié)合在一起，用于 精確地進行淡水和海水光合營養(yǎng)藻類和藍綠細 菌等的培養(yǎng)和監(jiān)測。培養(yǎng)條件可以根據(jù)用戶自定

15、義方案而動態(tài)變化，光能、光譜組成、溫度等可 以精確設(shè)定并可在幅度或頻率上振蕩變化。儀器 內(nèi)置雙調(diào)制熒光儀和顯像密度計等，培養(yǎng)物的生 長狀態(tài)可以即時由顯像密度計 （OD735測定735 nm的光散射值，葉綠素含量通過在680nm和735 nm的光密度差值（NDVI）來連續(xù)監(jiān)測，通過PSII 的光量子產(chǎn)量（Fm'-Fs）/Fm'測量可以監(jiān)測其瞬 時生理狀態(tài)。主要功能特點如下：1）內(nèi)置雙調(diào)制葉綠素熒光儀，實時監(jiān)測培養(yǎng)藻類的生理狀況，測量記錄熒光參數(shù)Ft，2)3)4)5)6)7)8)Fm QY等內(nèi)置光密度計，測量 葉綠素濃度OD680和OD735經(jīng)過校準可計算生物量（藻類細胞數(shù)量）、可同時測量監(jiān)測溫度、pH值、溶解氧等多 種參數(shù)，還可選配CO2/O2分析系統(tǒng)以實時 監(jiān)測耗氧與CO2排放精確控制溫度、光質(zhì)、光強、培養(yǎng)周期等， 如設(shè)置模擬晝夜節(jié)律培養(yǎng)等光質(zhì)可根據(jù)用戶需求在紅光、藍光、白光中 選擇單色或雙色光源，擴展光源中還可以加 入紅外光氣流速率、CO及Q濃度可精確控制（備選）， 并可進行恒化或恒濁培養(yǎng)通過RCM軟件可進行遠程網(wǎng)絡(luò)控制、數(shù)據(jù)圖 表瀏覽下載等可選配400ml培養(yǎng)器或1000ml培養(yǎng)器，還 可定制25L或120L等大型藻