地榆提取物抗氧化與抗過敏作用研究

1、地榆提取物抗氧化與抗過敏作用研究                      作者：魏智蕓 滕建文 黃麗 韋保耀 夏寧 馮志臣【摘要】  目的研究地榆提取物的抗氧化與抗過敏作用及其相關(guān)性。方法地榆經(jīng)乙醇提取，有機(jī)溶劑萃取，大孔樹脂HP-20分離純化，獲得不同提取部分。采用透明質(zhì)酸酶抑制率及對(duì)DPPH、羥基自由基、過氧化氫的清除作用來檢測(cè)提取物活性。結(jié)果地榆大孔樹脂40%

2、乙醇洗脫物透明質(zhì)酸酶的抑制率與各自由基清除率是所有提取物中最高的，其自由基清除率接近于原花青素和蘆丁，大于維生素C和兒茶素；地榆的提取物濃度與透明質(zhì)酸酶抑制率、氧自由基清除作用成正相關(guān)性。結(jié)論地榆是一種值得開發(fā)的抗過敏、抗氧化植物；地榆提取物的抗過敏機(jī)制與其具有較強(qiáng)的氧自由基清除作用有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  地榆 抗氧化 抗過敏Abstract：ObjectiveTo study the correlationship between antioxidant and anti-allergic effects of Sanguisorba officinalis.MethodsSangu

3、isorba officinalis was extracted with alcohol and then fractionated with organic solvents by turns, isolated and purified with macroporous resin HP-20, and different separated components were obtained. The extraction was studied and the inhibition rate on hyaluronidase activity, the scavenging rates

4、 on DPPH,·OH and H2O2  were evaluated . ResultsThe results showed that the inhibition rate on hyaluronidase of the samples S-H40% was the highest in all the components, the  scavenging rate on free radical was nearly equal to OPC and rutin, greater than Vc and  catechin , and the

5、re was a positive relationship between anti-allergic and anti-oxidation activities. ConclusionSanguisorba officinalis is a candidate for the antioxidant and antiallergic plant, its mechanism of antiallergic is related with its strong scavenging rate on free radical.Key words：Sanguisorba officinalis;

6、   Antioxidant;   Antiallergy地榆Sanguisorba officinalis L.是薔薇科(Rosaceae)地榆屬Sanguisorba L.植物的根及根狀莖,具有涼血止血，解毒斂瘡功效。主要分布于東北 、華北 、西北 、華東 、中南及廣西 ，廣布于歐洲和亞洲北溫帶，主要成分為鞣質(zhì)和三萜皂苷。研究表明地榆提取物能對(duì)抗ONOO-的腎損害作用，抑制細(xì)胞凋亡，改善氧化應(yīng)激和氧化損傷作用13。國(guó)外Katsumata4報(bào)道抗氧化劑可以有效過敏性疾病，因?yàn)榛钚匝跞绯蹶庪x子自由基、羥自由基促使肥大細(xì)胞釋放組胺，產(chǎn)生過敏反應(yīng)，因此，從

7、地榆的成分以及抗炎癥、抗氧化的效果看，地榆可能是良好的抗過敏植物來源。但是從目前的報(bào)道來看，地榆的抗過敏研究報(bào)道較少，主要集中在地榆的粗提物上，如地榆水提液可以明顯使實(shí)驗(yàn)小鼠增強(qiáng)2，4-二硝基氯苯所致遲發(fā)型過敏反應(yīng)，使鼠耳重量增加，具免疫增強(qiáng)作用5。地榆根的粗提物能夠抑制組胺介質(zhì)的釋放和TNF-的產(chǎn)生，具有良好治療即時(shí)型過敏的效果6。雖然Park KH通過老鼠的被動(dòng)皮膚測(cè)試及由compound 48/80 和Ca2+引發(fā)的過敏測(cè)試，表明了地榆對(duì)肥大細(xì)胞的抑制作用，其主要作用成分為5-O-D-(3-C羥甲基) 呋喃來蘇糖基D（2-羥甲基）阿拉伯呋喃糖的雙糖7，但沒有更多的報(bào)道過抗過敏的有效成分。

8、鑒于純天然植物的安全無副作用以及地榆的研究現(xiàn)狀，本文對(duì)地榆的粗提物進(jìn)行了初步分離，探討地榆提取物的抗氧化與抑制透明質(zhì)酸酶間的作用和內(nèi)在的關(guān)系，為抗過敏植物資源的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。1  材料與儀器1.1  試劑透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸酶，Sigma公司產(chǎn)品；對(duì)-二甲氨基苯甲醛（AR），上海試劑二廠產(chǎn)品；乙酰丙酮，天津試劑廠產(chǎn)品；鄰二氮菲，北京愛芳醫(yī)藥化工研制公司產(chǎn)品；過氧化氫，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；三(羥甲基)氨基甲烷，成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品。1.2  材料地榆，購于南寧市國(guó)人大藥房。1.3  儀器大孔樹脂HP-20，北京綠百草公司產(chǎn)品；紫外分

9、光光度計(jì)，日本島津產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，北京市醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；微量移液器，上海精密儀器廠產(chǎn)品；冷凍液循環(huán)泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥系統(tǒng)，美國(guó)LABCONCO公司產(chǎn)品。2  方法2.1  提取分離方法取地榆500 g，采用60%乙醇,70提取，冷凍干燥得到粗提物A，粗提物依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，并分別冷凍干燥得到樣B，樣C，樣D，以及萃余物水相E組分；用大孔樹脂HP-20對(duì)樣E進(jìn)行分離,洗脫體積均為2 BV,流速:1 BV/h,長(zhǎng)徑比:121，收集水、10%乙醇、40%乙醇和70%乙醇4部分的洗脫液， 冷凍濃縮干燥分別得到樣F，樣G，樣H，樣I 4個(gè)樣

10、品。2.2   透明質(zhì)酸酶抑制率實(shí)驗(yàn)抗過敏活性檢測(cè)：Elson-Morgan 改良法8的方法進(jìn)行測(cè)定，并各個(gè)樣品的抑制率。2.3  抗氧化實(shí)驗(yàn)2.3.1   羥基自由基的測(cè)定9將樣品配成濃度為0.4 mg·ml-1的溶液，取3只試管，分別加入2 ml pH=7.4的磷酸鹽緩沖液，1 ml 1.5mmol·L-1的鄰二氮菲溶液，充分混勻后，再加入1 ml 1.5mmol·L-1 FeSO4溶液，每加1管立即混勻，然后向其中1支試管加入1 ml的溶液（每次所加的體積不同），混勻。另兩支試管分別為損傷管和未損傷管，不加洗

11、脫溶液，再分別加入0.02%的H2O2 1 ml，未損傷管不加H2O2，最后補(bǔ)充各管體積至8 ml。于37下保溫1 h，測(cè)在510 nm下的吸光度，重復(fù)兩次，計(jì)算其平均值。OH的清除率（%）=（A2-A1）/（A0-A1）×100%A0：未損傷管的吸光度；A1：損傷管的吸光度；A2：加樣品并扣除樣品空白后的吸光度。2.3.2  過氧化氫清除實(shí)驗(yàn)10清除過氧化氫能力的測(cè)定按文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)，以pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制10 mmol·L-1H202溶液，取5 ml上述溶液加入5 ml樣品液（0.4 mg·ml-1），混勻后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在2

12、30 nm處的吸光值A(chǔ)1，實(shí)驗(yàn)中以不加樣品液的H2O2溶液吸光值為A0，以不加H2O2溶液的樣品溶液的吸光值為A2。過氧化氫的清除率()=A0-(A1-A2)A0×100%2.3.3    DPPH清除實(shí)驗(yàn)11分別取2 ml不同濃度的試樣液于試管中，加入 2×10-4mol·L-1的DPPH· 溶液2 ml，混合均勻，反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定其吸光度，同時(shí)測(cè)定試樣空白以及不加試樣液的空白樣的吸光度。按下式計(jì)算其對(duì)DPPH· 抑制率：      DPPH

13、·清除率（%）=1（A1A2）/A0× 100% 式中：A1=2 ml DPPH· 溶液+2 ml試樣液的吸光度；A2=2 ml試樣液+2 ml無水乙醇的吸光度；      A0=2 ml DPPH· 溶液+2 ml無水乙醇的吸光度。1         3  結(jié)果3.1  各提取物的透明質(zhì)酸酶抑制率原花青素、兒茶素都具有強(qiáng)有力的抗氧化作用，抗過敏作用。從表1可以看出，樣A經(jīng)溶劑萃取后得到樣E，樣E經(jīng)大孔樹脂

14、純化后得樣H，其透明質(zhì)酸酶的抑制率分別為47.70%，62.00%，76.00%，逐步升高。樣H的活性超過兒茶素，且提取率相對(duì)于其他樣品是較高的，因此選擇A，E，H作為下面抗過敏與抗氧化作用量效分析的樣品。從羥基自由基清除率與過氧化氫清除率來看，樣H的清除率是所有提取物最高的，其自由基清除率接近于原花青素和蘆丁，大于維生素C和兒茶素；過氧化氫清除率接近于原花青素，大于蘆丁、維生素C、兒茶素。因此，樣H在本實(shí)驗(yàn)中顯示了與原花青素相近的活性。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品H進(jìn)行了試管預(yù)測(cè)：樣品H可以使明膠溶液產(chǎn)生沉淀,推斷為單寧類物質(zhì)；樣品H噴灑三氯化鐵-鐵氰化鉀顯示為藍(lán)色,噴灑茴香醛-硫酸,樣品顏色顯

15、示為橙黃色,證明樣品H為縮合類單寧；加入溴水,樣品H溶液變渾濁,推測(cè)為縮合類單寧；樣品H加入香草醛-鹽酸溶液,顏色呈現(xiàn)紅色,推測(cè)樣品為縮合類單寧。此結(jié)果證實(shí)樣品H為與原花青素相似的縮合單寧類。表1  不同樣品自由基清除率和透明質(zhì)酶抑制率（略）3.2  不同濃度的提取物的透明質(zhì)酸酶抑制率的比較Kakegawa12等(1985)曾報(bào)道各種影響肥大細(xì)胞釋放組胺的藥物能調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸酶的活性，透明質(zhì)酸酶活性抑制和肥大細(xì)胞釋放組胺之間有很好的相關(guān)性。近年來，日本、韓國(guó)13，14等國(guó)家已將透明質(zhì)酸酶活性的抑制實(shí)驗(yàn)作為基本方法之一，從天然產(chǎn)物中大量篩選抗變態(tài)反應(yīng)化合物。由圖1可看出，地榆大

16、孔樹脂40%乙醇洗脫物在1 mg/ml抑制率已達(dá)76%，較低濃度0.5 mg/ml的抑制率達(dá)50%，可見地榆大孔樹脂40%洗脫物對(duì)透明質(zhì)酸酶有很強(qiáng)的抑制作用。地榆萃取后水相（E）及地榆醇提物（A）也都表現(xiàn)了明顯的抑制透明質(zhì)酸酶作用。在提取分離的過程中,通過不同極性溶劑的萃取分離,以及大孔樹脂的吸附分離,透明質(zhì)酸酶抑制率在每一步分離純化過程都得到提高,說明地榆中抗過敏成分得到了很好的富集。3.3  不同提取物對(duì)氧自由基的抑制作用的比較3.3.1  對(duì)羥自由基的清除作用   由圖2可知，地榆提取物A,E,H對(duì)羥自由基的清除作用，在所給范圍內(nèi)，隨著濃

17、度的升高，清除作用也逐漸增強(qiáng)，呈量效關(guān)系，在一定濃度范圍內(nèi)，清除能力與樣品濃度呈正相關(guān)。經(jīng)地榆各樣品的IC50 (清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度)分別為：0.4，0.42 ，0.26 mg/ml。3.3.2  對(duì)過氧化氫（H2O2）的清除作用由圖3可以看出，地榆3種提取物對(duì)H2O2有不同的清除效果，說明地榆多酚對(duì)H2O2有明顯的清除作用，且呈較好的量效關(guān)系。地榆萃取后水相物在低濃度范圍內(nèi)清除率上升的比較快，在高濃度范圍內(nèi)上升的較為緩慢。地榆大孔40%洗脫物清除能力相對(duì)最強(qiáng)，特別是低濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)明顯，在0.1 mg/ml，清除率就達(dá)到63%。經(jīng)計(jì)算地榆提取物清除H2O2的IC50分別為

18、：0.160，0.098，0.060 6 mg/ml。3.3.3  對(duì)DPPH的清除作用DPPH法是一種評(píng)價(jià)天然抗氧化劑抗氧化活性的快速、簡(jiǎn)便、靈敏、可行的方法，對(duì)自由基清除劑具有廣譜性篩選效果，在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用廣泛。由圖4可知，地榆提取物對(duì)DPPH的清除都呈正相關(guān)，是一種良好的天然抗氧化劑。經(jīng)計(jì)算地榆各樣品的IC50 (清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度)分別為： 0.49，0.121，0.089 mg/ml。4  結(jié)論大孔樹脂用于分離黃酮類、皂苷類、生物堿、多酚等。樣品通過大孔樹脂吸附，水洗脫物一般為糖類、蛋白質(zhì)等，因此推斷40%洗脫物H主要成分應(yīng)該是多酚類物質(zhì)，而不是已被證明的

19、地榆中具有抗過敏性的多糖類物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明其抗過敏性與原花青素相近，原花青素已證明有良好的抗過敏和抗氧化活性15，并已開發(fā)成產(chǎn)品如安佐康膠囊。因此推斷地榆多酚是一種良好的抗過敏、抗氧化物質(zhì)。通過樣A，E，H的不同濃度的透明質(zhì)酸酶抑制率和對(duì)氧自由基的抑制作用的比較，透明質(zhì)酸酶抑制率與清除氧自由基具有共同上升的趨勢(shì)，說明地榆提取物的透明質(zhì)酸酶抑制率與氧自由基清除率之間具有一定的正相相關(guān)性，這可能與地榆鞣質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中存在大量的羥基或某些羥基的特定位置有關(guān)。可以預(yù)測(cè)地榆抗過敏機(jī)制與其具有較強(qiáng)的氧自由基清除作用有關(guān), 能有效阻斷致敏物質(zhì)的釋放，從而去除過敏癥狀。這將對(duì)地榆抗過敏作用的機(jī)制研究上提供幫助?！?/p>

20、】  1翁小剛.地榆對(duì)過氧化亞硝酸鹽所致腎損害的保護(hù)作用J.國(guó)外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊(cè)，2000，24（3）：173.2聶淑琴.地榆對(duì)缺血-再灌注致凋亡和腎損傷的保護(hù)作用J.國(guó)外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊(cè)，2001，23（2）：167.3聶淑琴.地榆提取物對(duì)老化加速小鼠抗氧化保護(hù)能力的影響J.國(guó)外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊(cè)，2001，23（2）：89.4Katsumata,U.，Miura, M.，Ichinose,M. Oxygen radicals produce airway constriction hyperresponsiveness in anesthetiz

21、ed catsJ.Am Rev. Respir . Dis. 1990，141(5):1158.5Shin, Tae-Yong. Anti-Allergic Effects of Sanguisorba Officinalis on Animal Models of Allergic ReactionsJ. Immunopharmacology & Immunotoxicology,2002, 24( 3),455.6Tracey K J, Loury S F, Cerami A. Cachect in/TNF-inseptic shock and septic adult respiratory dirtress syndromeJ.Am Rev Respir Dis,1988,138:1377.7Park KH， Koh D， Kim K， Park J. Lim Y Antiallergic activity of a disaccharide isolated from Sanguisorba officinalis. Phyto