生物技術(shù)實(shí)踐(生物選修一）知識(shí)復(fù)習(xí)圖解

1、果酒和果醋的制作挑選葡萄沖洗榨汁酒精發(fā)酵醋酸發(fā)酵注意：要先清洗后除枝梗(避免除去枝梗時(shí)引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機(jī)會(huì)，同時(shí)，防止葡萄汁流失)不能反復(fù)沖洗(避免菌種流失)注意：選擇新鮮的葡萄注意：榨汁機(jī)要清洗干凈，并晾干(防雜菌污染)避免將果核壓破(因果核含有多種有害葡萄酒風(fēng)味的物質(zhì))原理：主要菌種是酵母菌。酵母菌是異養(yǎng)兼性厭氧微生物C6H12O6C2H5OHC02溫度：20左右最適合酵母菌繁殖，一般控制在1825。果酒果醋注意：發(fā)酵裝置要清洗干凈，并用體積分?jǐn)?shù)為70的酒精消毒發(fā)酵瓶裝入葡萄汁后留有l(wèi)/3的空間(目的是先讓酵母菌進(jìn)行有氧呼吸快速繁殖，耗盡氧氣后再進(jìn)行酒精發(fā)酵；其次，防止發(fā)酵過(guò)

2、程中產(chǎn)生的CO2造成發(fā)酵液的溢出)如用帶蓋的瓶子制葡萄酒，每隔12 h左右將瓶蓋擰松一次(注意不是打開(kāi)瓶蓋，防雜菌污染)，之后再將瓶蓋擰緊(目的:排出多余的氣體放炸裂)裝入葡萄汁封閉充氣口(無(wú)氧環(huán)境和放雜菌污染)發(fā)酵過(guò)程中，隨著酒精度數(shù)的提高，葡萄酒呈現(xiàn)深紅色(因紅葡萄皮的色素也進(jìn)入發(fā)酵液)酒精的鑒定:與酸性重鉻酸鉀呈灰綠色對(duì)照組2mL白酒實(shí)驗(yàn)組2mL發(fā)酵液試管甲2mL發(fā)酵前液試管乙2mL發(fā)酵后液3mL/L的H2SO43滴混勻重鉻酸鉀3滴觀察3mL/L的H2SO43滴混勻重鉻酸鉀3滴觀察原理：主要菌種是醋酸桿菌(異養(yǎng)需氧型)當(dāng)氧氣糖源均充足時(shí)，糖醋酸當(dāng)氧氣充足、缺少糖源時(shí)，乙醇乙醛醋酸溫度：3

3、035。注意：需適時(shí)通入空氣高考警示：由于醋酸菌和乳酸菌屬于原核生物，所以在利用者兩類微生物時(shí)，其環(huán)境中一定不能加入抗生素。酵母菌在營(yíng)養(yǎng)和氧氣充足時(shí)進(jìn)行出芽生殖選修1生物技術(shù)實(shí)踐知識(shí)歸納圖解微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（一）培養(yǎng)基的基本知識(shí) 1培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)定義作用主要來(lái)源及所涉及的微生物碳源凡是能提供微生物所需碳元素的物質(zhì)構(gòu)成生物細(xì)胞、生物體及細(xì)胞代謝產(chǎn)物，有些能為異養(yǎng)生物提供能源無(wú)機(jī)化合物：C02、NaHC03等(自養(yǎng)生物)有機(jī)化合物：糖類、脂質(zhì)、花生粉餅、石油等(異養(yǎng)生物)氮源凡是能提供微生物所需氮元素的物質(zhì)合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮的代謝產(chǎn)物，也可為異養(yǎng)微生物提供能源無(wú)機(jī)化合物：N2、NH

4、3、銨鹽、硝酸鹽，自養(yǎng)生物有機(jī)化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等，異養(yǎng)生物水分生物體內(nèi)含量最高的組成成分，分為結(jié)合水和自由水良好的溶劑、細(xì)胞生活及生化反應(yīng)的介質(zhì)、參與物質(zhì)運(yùn)輸及參與生化反應(yīng)的反應(yīng)物培養(yǎng)基、大氣、代謝產(chǎn)物無(wú)機(jī)鹽為微生物提供大量除C、H、0以外的各種元素細(xì)胞組成成分，生命調(diào)節(jié)物質(zhì)，自養(yǎng)菌的能源或其他營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，酶的激活劑培養(yǎng)基、大氣等環(huán)境生長(zhǎng)因子微生物正常生長(zhǎng)繁殖，必不可少的微量有機(jī)物可作為酶與核酸等的組成成分維生素、氨基酸、堿基等高考警示鐘自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同(1)自養(yǎng)微生物所需的碳源、氮源來(lái)自含碳、含氮的無(wú)機(jī)物，而異養(yǎng)微生物需要的碳源、氮源來(lái)自含碳、含氮的有機(jī)物，

5、因此可根據(jù)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類型。(2)含氮無(wú)機(jī)物不但能給自養(yǎng)微生物提供氮源，也能作為能源物質(zhì)，提供能量，如NH3既作為硝化細(xì)菌的氮源也作為能源。2培養(yǎng)基的配制原則 (1)目的明確。要根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等選擇原料、配制培養(yǎng)基。 (2)營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)。各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要保證適當(dāng)?shù)臐舛群捅壤I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比例過(guò)低，不能滿足微生物生長(zhǎng)；濃度過(guò)高則會(huì)抑制微生物的正常生長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度比(如C/N)還會(huì)直接影響某些微生物的代謝產(chǎn)物，如谷氨酸生產(chǎn)，C/N=41時(shí)，菌體大量繁殖，谷氨酸產(chǎn)量少；而C/N=31時(shí)，菌體繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大。 (3)pH要適當(dāng)。不同微生物生長(zhǎng)所需pH不同。如細(xì)

6、菌pH保持在6.57.5之間；放線菌保持在7.58.5之間；真菌應(yīng)保持在5.06.0之間。3培養(yǎng)基的分類及作用：培養(yǎng)基種類很多，作用也不同。根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，可將培養(yǎng)基分為不同種類。劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途及實(shí)例物理性質(zhì)液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)半固體培養(yǎng)基加凝固劑，如：瓊脂觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類鑒定、保藏菌種固體培養(yǎng)基微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、化學(xué)成分天然培養(yǎng)基含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分明確(用化學(xué)成分已知的化學(xué)物質(zhì)配成)分類、鑒定用途選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)、分離出特定微生物(如：培養(yǎng)酵

7、母茵或霉菌，可在培養(yǎng)基中加入青霉素；培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，可在培養(yǎng)基中加入高濃度食鹽)鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品鑒別不同種類的微生物，如可用伊紅一美藍(lán)培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，茵落呈深紫色，并帶有金屬光澤)說(shuō)明：病毒為非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物體，專營(yíng)活細(xì)胞寄生，目前不能利用人工培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)，需接種在動(dòng)植物組織中才能增殖。常用于培養(yǎng)病毒的是活雞胚。加入培養(yǎng)基中的凝固劑(如瓊脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。選擇培養(yǎng)基一般只生長(zhǎng)具有特定的微生物，鑒別培養(yǎng)基可以存在其他微生物，而且能鑒別特定的微生物。注意：選擇培養(yǎng)基的選擇方法(1)在培養(yǎng)

8、基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。例如，加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可以得到金黃色葡萄球菌。這里的加入是在主要營(yíng)養(yǎng)成分完整的基礎(chǔ)上加入。(2)改變培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分。例如缺乏氮源時(shí)可以分離出固氮微生物；石油作為惟一碳源時(shí)，可以分離出消除石油污染的微生物。(3)改變微生物的培養(yǎng)條件。例如，將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境下培養(yǎng)，可以得到耐高溫的微生物。（二）滅菌技術(shù)1無(wú)菌技術(shù)的概念 在微生物培養(yǎng)中，獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌入侵，其主要技術(shù)是無(wú)菌操作。無(wú)菌技術(shù)是指通過(guò)一定物理、化學(xué)的手段，防止實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物被外來(lái)微生物污染。無(wú)菌技術(shù)主要圍繞如何避免雜菌污染展開(kāi)的。2消毒、滅菌的方法 項(xiàng)目概念

9、常用方法應(yīng)用范圍消毒使用較為溫和的物理或化學(xué)方法，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體等有害的微生物(不包括孢子和芽孢)巴氏消毒法：7075水中煮30min或在80水中煮15min一些不耐高溫的物體如牛奶煮沸消毒法：在100水浴中煮沸56 min一般物品化學(xué)藥劑消毒法：用乙醇、氯氣、漂白粉、KMnO4等藥劑來(lái)殺死或抑制細(xì)菌生長(zhǎng)或繁殖可用來(lái)對(duì)環(huán)境、雙手和衣物等消毒紫外線消毒法：30W紫外燈照射30min接種室滅菌使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌法：酒精燈火焰接種工具如接種環(huán)、接種針等干熱滅菌法：在160170加熱12h如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具高壓蒸汽滅菌

10、：壓力為100 kPa，溫度為12l的條件下，維持1530 min培養(yǎng)基及容器的滅菌注意：無(wú)菌操作是微生物培養(yǎng)過(guò)程中，防止雜茵污染的關(guān)鍵步驟。消毒只能消滅或抑制營(yíng)養(yǎng)體的活動(dòng)，而不能達(dá)到徹底滅菌。酒精消毒用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精效果最好，因濃度過(guò)高，會(huì)使菌體表面蛋白凝固成一層保護(hù)膜，乙醇分子不能進(jìn)入其中；濃度過(guò)低，殺菌力減弱。而滅菌除殺死營(yíng)養(yǎng)體外，還必須殺死芽孢和孢子。滅菌消毒的原理，就是通過(guò)一定理化手段，使病原茵蛋白質(zhì)變性，失去生命活性。（三）微生物的純化培養(yǎng)技術(shù)1常用細(xì)菌培養(yǎng)基蛋白胨培養(yǎng)基配制流程：計(jì)算稱量溶化滅菌注意：據(jù)配方計(jì)算配制一定體積培養(yǎng)基時(shí)各成分的用量注意：倒平板時(shí)，燒杯口要通過(guò)酒

11、精燈火焰滅菌。平板冷凝后要將平板倒置，以確保拿放方便，同時(shí)避免水分蒸發(fā)，以利微生物生長(zhǎng)，也可防止皿蓋上凝結(jié)的水滴滴入培養(yǎng)基，影響pH；其次防止細(xì)菌透過(guò)皿底、皿蓋的縫隙，落在培養(yǎng)基上。倒平板時(shí)，不能將培養(yǎng)基濺在皿底與皿蓋之間，以防止雜菌滋生，污染培養(yǎng)基（調(diào)PH）倒平板注意：牛肉膏較粘稠，應(yīng)玻棒挑取，在稱量紙上稱量牛肉膏蛋白胨易吸潮，動(dòng)作要迅速注意：溶化瓊脂時(shí)要控制火力的大小并不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦；加熱過(guò)程中部分水分蒸發(fā)，待瓊脂完全溶化后應(yīng)補(bǔ)加蒸餾水，以保持溶液的濃度注意：由于不同微生物適宜的pH不同，因此在熔化后，必須用NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié)pH裝瓶注意：分裝至試管時(shí)培養(yǎng)基的高度不要超

12、過(guò)試管高度的1/5注意：可用高壓蒸汽滅菌法用干熱滅菌法時(shí)溫度160170(不能超過(guò)180，否則易引起報(bào)紙等燃燒)一般是培養(yǎng)基先滅菌再倒平板，也可先倒平板,再滅菌2純化大腸桿菌原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌稀釋或分散成單個(gè)細(xì)胞，使其長(zhǎng)成單個(gè)的菌落，這個(gè)菌落就是純化的細(xì)菌菌落。微生物接種方法： (1)平板劃線法：平板劃線法中細(xì)胞的分離和稀釋過(guò)程發(fā)生在接種環(huán)在固體平板表面上的劃線和移動(dòng)過(guò)程中。在線的開(kāi)始部分，微生物往往連在一起生長(zhǎng)，隨著線的延伸，菌數(shù)逐漸減少，最后可能形成純種的單個(gè)菌落。(如圖) (2)稀釋涂布平板法：10倍系列稀釋操作劃線操作時(shí)注意：（1）用接種環(huán)取菌種之前、每次劃線之前和劃線結(jié)束都要進(jìn)行

13、灼燒滅菌，灼燒后要在酒精燈附近冷卻后再操作；(第一次操作：殺死接種環(huán)上原有的微生物。每次劃線之前：殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端。劃線結(jié)束后：殺死接種環(huán)上殘存的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者)（2）劃線時(shí)不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基，如果采用分段劃線法操作從第二次操作應(yīng)總在上一次劃線末端開(kāi)始，首尾區(qū)不能相連；（3）操作必須始終在酒精燈火焰旁進(jìn)行。涂布操作時(shí)注意：（1）配制系列梯度稀釋液時(shí)，所用的試管和移液管均需滅菌，必須用無(wú)菌水配制；（2）涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在燒杯中滴盡，沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰引燃。不要將過(guò)熱的涂布器放入盛有酒精的燒杯

14、中，一面引燃其中的酒精；（3）配制系列梯度稀釋液和轉(zhuǎn)移菌液以及涂布過(guò)程等必須都在酒精燈火焰旁進(jìn)行，移液管頭不能接觸任何物體。3菌種的保存 對(duì)于頻繁使用的菌種，可以采用臨時(shí)保藏的方法。 對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。注意：菌種保藏的原理是：低溫、干燥和隔絕空氣，使微生物代謝能力和繁殖能力降低。不同菌種的保藏方法因不同菌種而異。需氧型，必須低溫有氧，而厭氧型必須低溫?zé)o氧；腐生微生物可提供牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，而寄生微生物需提供活體組織等非人工培養(yǎng)基，如病毒需提供活雞胚。（三）微生物的篩選與計(jì)數(shù)（以“土壤中分解尿素的細(xì)菌”為例）篩選菌株原則：人為提供有利于目的菌生長(zhǎng)的條件，同時(shí)抑制或

15、阻止其他微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的成分：尿素作為惟一的氮源(選擇培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基)菌落計(jì)數(shù)菌種的鑒定對(duì)照：將不接種的培養(yǎng)基置于相同溫度恒溫箱培養(yǎng)(目的:證實(shí)培養(yǎng)基是否被雜菌污染)統(tǒng)計(jì)茵落數(shù)目的方法：(1)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法原理：利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積樣品中微生物數(shù)量方法：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌。(2)間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法)原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)(C÷V)×M，其中，C代表某一稀釋度

16、下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。操作：設(shè)置重復(fù)組，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。同時(shí)為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。方法：檢測(cè)培養(yǎng)基pH的變化判斷原理：在細(xì)菌分解尿素時(shí)，分泌的脲酶將尿素分解為氨，氨使培養(yǎng)基堿性增高，pH升高 菊花的組織培養(yǎng) 制備MS培養(yǎng)基外植體消毒接種成分：無(wú)機(jī)物(大量元素、微量元素)、有機(jī)物：糖類(最常使用的糖是蔗糖，提供能源和維持滲透壓)、維生素、氨基酸、有機(jī)添加劑（生長(zhǎng)因子）、激素pH：5.8左右滅菌：高壓蒸汽滅菌注意：為降低工作量、減少誤差，可通過(guò)配制母液，達(dá)到一次稱量藥品、多次使用。配制培

17、養(yǎng)基時(shí)，母液的應(yīng)用應(yīng)先搖勻，移液用的移液管或量筒需清洗兩次，以免造成誤差。培養(yǎng)試管苗愈傷組織胚狀體(或不定芽)脫分化再分化移栽(煉苗)栽培材料：植物的種類、年齡、保存時(shí)間消毒原因：大部分來(lái)自田間，帶有大量病毒、細(xì)菌菊花莖段消毒：所用消毒劑為體積分?jǐn)?shù)為70的酒精和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1的氯化汞溶液，所使用的清洗液是無(wú)菌水。注意：不同植株或同一植株的不同部位，所選用的消毒劑種類及濃度可能不同；方法：始終在酒精燈火焰旁進(jìn)灼燒滅菌。注意：將菊花莖段插入培養(yǎng)基時(shí)不要倒插溫度：1822光照：在初期菊花的組織培養(yǎng)需光照，月季的花藥培養(yǎng)不需光照(有利愈傷組織形成)，二者后期均需要光照(有利葉綠素形成和光合作用)注意

18、：生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的使用 使用順序不同結(jié)果不同(先生長(zhǎng)素，后細(xì)胞分裂素：有利于細(xì)胞分裂，但不分化先細(xì)胞分裂素，后生長(zhǎng)素：細(xì)胞既分裂也分化同時(shí)使用： 分化頻率提高) 用量比例不同發(fā)育方向不同(高：利用根的分化，抑制芽的形成低：利用芽的分化，抑制根的形成適中：促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng))注意：培養(yǎng)一株完整的試管苗，必須先進(jìn)行生芽培養(yǎng)，然后進(jìn)行生根培養(yǎng)，如果順序顛倒，先誘導(dǎo)生根，就不好誘導(dǎo)生芽了。原因：因試管苗光合作用能力低，對(duì)不良環(huán)境耐受力差，一定要在保溫、保濕一段時(shí)間以增強(qiáng)適應(yīng)力方法：流水清洗根部，移栽至消過(guò)毒的蛭石或珍珠巖環(huán)境培養(yǎng)脫分化階段只分裂；再分化階段既有分裂也有分化人工種子制備階段原理：細(xì)胞

19、的全能性(高度分化的植物細(xì)胞，仍具有發(fā)育為完整個(gè)體的潛能) (1)原因：體細(xì)胞攜帶有本物種全部的遺傳信息 (2)實(shí)現(xiàn)的條件：離體狀態(tài)和適宜條件(水分、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)及激素、溫度、pH等)(3)細(xì)胞的全能性大小與細(xì)胞種類的關(guān)系：受精卵生殖細(xì)胞體細(xì)胞；植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞；分化程度低的細(xì)胞分化程度高的細(xì)胞一般的，離體的植物細(xì)胞的全能性在一定條件下可充分地體現(xiàn)出來(lái)。離體的動(dòng)物細(xì)胞的全能性受到限制，但其細(xì)胞核的全能性借助卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可體現(xiàn)出來(lái)。未離體的細(xì)胞的全能性不能表達(dá)，只是在機(jī)體的調(diào)控下進(jìn)行定向分化。 果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用 一、果膠酶的組成和作用：包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠分解酶、果膠酯酶等。

20、果膠酶能分解果膠，瓦解植物的細(xì)胞壁及胞間層。其實(shí)質(zhì)是果膠分解成可溶性的半乳糖醛酸。注意：果膠酶是分解果膠的一類酶的總稱，不是一種酶。 植物、霉菌、酵母菌等細(xì)胞均能產(chǎn)生果膠酶，但通常動(dòng)物細(xì)胞不產(chǎn)生果膠酶。在植物細(xì)胞工程中，應(yīng)用纖維素酶和果膠酶來(lái)破壞細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體。二、探究溫度對(duì)果膠酶活性的影響(1)實(shí)驗(yàn)原理：果膠酶活性受溫度影響，處于最適溫度時(shí)，活性最高；低于或高于最適溫度，酶活性受到抑制。即果肉的出汁率、果汁的澄清度與果膠酶的活性大小成正比。(2)設(shè)計(jì)思路：設(shè)置一系列梯度溫度，從中選出酶活性最高的溫度，然后再以該溫度為中心，縮小溫度梯度向兩個(gè)方面各設(shè)置梯度溫度，以進(jìn)一步確定最適溫度范圍。

21、所選擇的溫度只能接近最適溫度，但不一定就是最適溫度。(3)實(shí)驗(yàn)操作流程及注意事項(xiàng)制備水果泥注意：蘋果、橙子和葡萄等水果都可以作為反應(yīng)物，水果不用去皮。如用蘋果為原材料，一般可按每個(gè)中等大小的蘋果加水100200 mL的比例進(jìn)行攪拌，獲得稀的蘋果泥制備果膠酶水果泥、果膠酶分別水浴保溫水果泥、果膠酶混合水浴保溫記錄果汁量自變量：溫度(應(yīng)控制為唯一) 對(duì)照：相互對(duì)照無(wú)關(guān)變量：果泥量、果膠酶的濃度和用量、水浴時(shí)間和混合物的pH等所有其他條件(應(yīng)控制為相同)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案確定溫度梯度探討控制溫度的方法和措施確定水果的種類確定制備果汁的方法確定實(shí)驗(yàn)用的水果量確定果膠酶的量探討測(cè)定果膠酶活性的方法動(dòng)手實(shí)驗(yàn)過(guò)濾

22、出果汁改變不同溫度后重復(fù)上面實(shí)驗(yàn)(也可同時(shí)進(jìn)行不同溫度的實(shí)驗(yàn))記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出結(jié)論記錄表格設(shè)計(jì)溫度/ 10 20 30 40 50 60果汁量/mL原因：將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理，可以保證底物和酶在混合時(shí)的溫度是相同的，避免了果泥和果膠酶混合時(shí)影響混合物的溫度，從而影響果膠酶活性的問(wèn)題原因：讓果泥和果膠酶有充分的反應(yīng)時(shí)間通過(guò)測(cè)定濾出的蘋果汁的體積大小來(lái)判斷果膠酶活性的高低原因：果膠酶將果膠分解為小分子物質(zhì)，小分子物質(zhì)可以通過(guò)濾紙，因此蘋果汁的體積大小反應(yīng)了果膠酶的催化分解果膠的能力。在不同的溫度和pH下，果膠酶的活性越大，蘋果汁的體積就越大 注意：過(guò)濾果汁時(shí)漏斗中應(yīng)放置濾紙注意

23、：每個(gè)探究實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，都要遵循實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一般原則，特別是單因子變量控制原則。每個(gè)探究實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路希是大梯度差值尋找最適范圍，再小梯度差值選出最適溫度、pH或酶用量。如果隨酶濃度增加，果汁體積也增大，說(shuō)明酶用量不足；當(dāng)酶用量達(dá)一定值時(shí)，再增加酶用量，果汁體積不變，則說(shuō)明這個(gè)值就是酶的最適用量。如果變量(溫度、pH、酶濃度)梯度無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)，即出現(xiàn)過(guò)高、過(guò)低等現(xiàn)象，則應(yīng)及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)。血 紅 蛋 白 的 提 取 和 分 離一、實(shí)驗(yàn)原理：蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。1凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原 理：分子量大的分

24、子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過(guò)程：混合物上柱洗脫大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢收集大分子收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。（4）作用：分離蛋白質(zhì)，測(cè)定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。2緩沖溶液（1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H2CO3NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。3凝膠電泳法：（1）原 理：不

25、同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（3）分離過(guò)程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。二、實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)血紅蛋白的釋放過(guò)程：采集血樣(加檸檬酸鈉防止血液凝固)低速短時(shí)離心(防止白細(xì)胞沉淀)吸取血漿生理鹽水洗滌(防紅細(xì)胞破裂)緩慢攪拌(防止紅細(xì)胞破裂釋)低速短時(shí)離心重復(fù)洗滌三次上清液中無(wú)黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。目的：除去雜蛋白紅細(xì)胞的洗滌過(guò)程：加蒸

26、餾水加40體積的甲苯磁力攪拌器攪拌目的：紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白注意：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離分離血紅蛋白溶液過(guò)程：離心（2000r/min）目的：分離血紅蛋白和其他雜質(zhì)結(jié)果第1層(最上層)：甲苯層(無(wú)色透明) 第2層(中上層)：脂溶性物質(zhì)的沉淀層(白色薄層固體)第3層(中下層)：血紅蛋白的水溶液層(紅色透明液體) 第4層(最下層)：雜質(zhì)的沉淀層(暗紅色)透 析原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)過(guò)程：血紅蛋白溶液裝入透析袋將透析袋放入磷酸緩沖液中透析12h目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)或用于更換樣品

27、的緩沖液1.樣品處理2.粗分離3.純 化調(diào)節(jié)緩沖液面打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口加入蛋白質(zhì)樣品調(diào)節(jié)緩沖液面洗 脫收集分裝蛋白質(zhì)4.純度鑒定凝膠色譜柱裝填步驟：固定(色譜柱垂直固定在支架)裝填(將凝膠懸浮液一次性裝填) 洗滌(目的：使凝膠裝填緊密)要求：緊密、均勻(否則，會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果)裝填成功檢測(cè)：凝膠是一種半透明的介質(zhì)，可在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動(dòng)是否均勻、狹窄、平整。如紋路或是

28、氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，否則重新裝柱。用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動(dòng)加到色譜柱的頂端。加樣后，打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后，關(guān)閉出口加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口，進(jìn)行洗脫方法：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集檢測(cè)分離是否成功：如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(選做)胡 蘿 卜 素 的 提 取 一、胡蘿卜素基礎(chǔ)知識(shí)1原理：根據(jù)胡蘿卜素易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，可采取有機(jī)溶劑萃取的方法來(lái)提取胡蘿卜素。即將粉碎、干燥的植物原料用有