實(shí)驗室常用試驗方法

1、實(shí)驗室常用試驗方法總RNA的提取（Trizol法提?。┰谑占缴锊牧现螅詈媚芗纯踢M(jìn)行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細(xì)胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。1.提取組織RNA時，每50100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進(jìn)行裂解；提取細(xì)胞RNA時，先離心沉淀細(xì)胞，每5-10 106個細(xì)胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞；2.將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫1530C下放置5分鐘；3.在上述EP管中，按照每

2、1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（1530）放置23分鐘后，12000g（28）離心15分鐘；4.取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（1530）放置10分鐘,12000g（28）離心10分鐘；5.棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g（28）離心5分鐘，棄上清；6.讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。PCR 實(shí)驗室常用DNA聚合酶有三種：TaKaRa TaqTM，TaKaRa

3、 EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性較差，但價錢便宜，一般用于基因表達(dá)的檢測等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物3端附有一個“A”堿基，如果希望直接將產(chǎn)物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，其特點(diǎn)是保真性極高，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物為平滑末端。如果進(jìn)行基因的擴(kuò)增請使用此酶。1.按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反

4、應(yīng)液：TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方ReagentQuantity, for 50µl of reaction mixture10X PCR buffer （Mg2+ free）5 µlMgCl2（25mM）如TaKaRa TaqTM加3 µl 如TaKaRa EXTaqTM加4 µl2.5mM dNTP mix4 µl 10µM Primer 上游1 µl10µM Primer下游1 µlTemplate DNA1 µlTaq或EXTaqDNA Polymeras

5、e0.25 µlSterile deionized waterUp to 50µlTotal50 µl /SamplePyrobestTM DNA Polymerase的配方ReagentQuantity, for 50µl of reaction mixture10X Pyrobest buffer 5µl2.5mM dNTP mix4µl 10µM Primer上游1µl10µM Primer 下游1µlTemplate DNA1µlPyrobestTM DNA Polymeras

6、e0.25µlSterile deionized waterUp to 50µlTotal50µl /Sample反應(yīng)總體積根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)控，可以做2050µl以節(jié)約試劑；將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中；如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加30 50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發(fā)；2.按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異，在實(shí)際操作中需根據(jù)具體的情況以及PCR結(jié)果而進(jìn)行優(yōu)化。StepTemperature, °C Time, minNumbe

7、r of cyclesNote起始變性94951-31變性94950.5-225-35退火溫度比理論退火溫度大概低5°C，再根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化退火37-700.5-2延伸70-75根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小每分鐘延伸1000bp最終延伸70-75101反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴(kuò)增樣品5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNA marker判斷擴(kuò)增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。 本帖被評分 1 次 TOP  發(fā)送短消息查看公共資料 查找該會員全部帖子· UID:754 · 精華: 2 · 威望:4 · 金幣:2787 元

8、 · 元寶:468 個 · 貢獻(xiàn):108 點(diǎn) · 來自: · 注冊: 2008-10-09 狀態(tài): 離線 · 407827254 2 RT-PCRProtocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) 1. 按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液ReagentQuantity, for 50µlof reaction mixture10×One Step RNA PCR Buffer5µl25 mM MgCl210µl10 mM dNTP mix5µlRNase I

9、nhibitor (40 U/µl)1µlAMV-Optimized Taq1µlAMV RTase XL (5 U/µl)1µl上游特異Primer (20 µM)1µl下游特異Primer (20 µM)1µl實(shí)驗樣品RNA（1 µg Total RNA）1µlRNase Free dH2O24µlTotal50µl /Sample1.反應(yīng)總體積根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)控，可以做2050µl以節(jié)約試劑；2.將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR

10、薄壁管中；3.如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加30 50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發(fā)；2按以下條件進(jìn)行反應(yīng)StepTemperature, °CTime, minNumber of cyclesNote逆轉(zhuǎn)錄50301逆轉(zhuǎn)錄酶失活9421變性940.525-35退火37-650.5退火溫度比理論退火溫度大概低5°C，再根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化延伸72根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小Taq酶每分鐘延伸1000bp最終延伸72101反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴(kuò)增樣品5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNA marker判斷擴(kuò)增片段的大小或冷凍保存，以備以后

11、分析使用。瓊脂糖核酸電泳1.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；2.根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi)，定量加入電泳緩沖液（一般2030 ml）；3.放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；4.室溫下3045分鐘后凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；6.在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading bu

12、ffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi)；7.接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負(fù))。一般60100V電壓，電泳2040min即可；8.根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；9.電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。 瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,00

13、0 TOP  發(fā)送短消息查看公共資料 查找該會員全部帖子· UID:754 · 精華: 2 · 威望:4 · 金幣:2787 元 · 元寶:468 個 · 貢獻(xiàn):108 點(diǎn) · 來自: · 注冊: 2008-10-09 狀態(tài): 離線 · 407827254 # 膠回收純化DNA1.瓊脂糖電泳，將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中，稱瓊脂糖帶的重量；2.按照每100mg加400µl的量加入binding buffer，放入到EP管振蕩器中，4555溫育振蕩，直到所有的瓊脂糖都溶解

14、（大概要5分鐘）；3.取出純化柱，將上述溶解液轉(zhuǎn)移至柱中，室溫下放置2分鐘，8,000rpm 離心1分鐘，棄EP管中的液體，將純化柱放回EP管中；4.加500µl的wash buffer至柱中，8,000rpm 離心1分鐘。棄管中的溶液；5.重復(fù)操作4步的操作1次，最后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒，除去痕量的wash buffer；6.將純化柱放入一個新的EP管。加3040µl H2O或者elution buffer至純化柱膜的中央，在37或50下放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，將EP管中的DNA溶液放在-20保存。7.注：若想要不電

15、泳而直接純化DNA溶液，只需要在第2步中按100µl液量加400µl的binding buffer,其余的步驟不變。大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切PCR擴(kuò)增。1.取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物于EP管中，4000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細(xì)菌沉淀盡量干燥；2.將細(xì)菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，劇烈振蕩；3.加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mo

16、l/L NaOH，1SDS（m/v）)，蓋緊EP管口，快速顛倒離心管5次，以混合混合物，確保離心管的整個內(nèi)表面與溶液II接觸，不要渦旋，置于冰浴中；4.加入150 µl預(yù)冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，蓋緊EP管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上35分鐘；5.在最大轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液于另一新EP管；6.用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合于室溫放置2分鐘，最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘；7.小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體

17、都流出，在將附于管壁的液滴除盡；8.加1ml 70乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用12,000g離心2分鐘，棄上清，將開口的EP管置于室溫使乙醇揮發(fā)，直至EP管中內(nèi)沒有可見的液體存在（510分鐘），用適量的ddH2O溶解；9.用0.5µl的RNase 37溫育510分鐘；10.電泳鑒定。乙醇沉淀DNA1.加入1/10體積的乙酸鈉（3 molL，PH=5.2）于DNA溶液中充分混勻，使其最終濃度為0.3 molL；2.加入2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20中1530分鐘；3.12,000 g離心10分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；4.加入1/2離心管容量的70乙醇

18、，12000g離心2分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；5.于室溫下將開蓋的EP管的置于實(shí)驗桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干；6.加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。酶  切1.酶切前確定待切樣品的濃度, 并選擇合適的限制性內(nèi)切酶和配套Buffer。2.在離心管中加入如下成分：10×Buffer1l 待切樣品xl酶0.5-1l加水補(bǔ)足10l3.混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。4.將離心管置于37中溫育1-3hr，若待切樣品為PCR產(chǎn)物，則可將反應(yīng)時間適當(dāng)延長。5.用未酶切的質(zhì)粒作為對照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。注：當(dāng)酶切樣品用于回收而不是鑒定時，可按比例適當(dāng)加大反應(yīng)體積。

19、雙酶切可選用二者活性都較高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反應(yīng)。）連 接1.連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。2.在離心管中加入如下成分：10×連接Buffer 1l 待連接的樣品（膠回收產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物，載體與片段的mol比為13-5）連接酶0.5-1l加水補(bǔ)足10l3.混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。4.將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當(dāng)?shù)臅r間（根據(jù)不同公司的酶的要求而定，一般為22 1-3hr或16連接過夜）。連接完的樣品可直接用于轉(zhuǎn)化，也可放4冰箱短期保存。 TOP  發(fā)送短消息查看公共資料 查找該會員全部帖子· UID:

20、754 · 精華: 2 · 威望:4 · 金幣:2787 元 · 元寶:468 個 · 貢獻(xiàn):108 點(diǎn) · 來自: · 注冊: 2008-10-09 狀態(tài): 離線 · 407827254 感受態(tài)細(xì)胞的制備1.挑取適當(dāng)菌株的E.coli單菌落接種于2ml SOB培養(yǎng)液中，37搖床過夜。2.取0.5-1ml過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到50ml SOB中，18劇烈震蕩，直到A600達(dá)到0.6。3.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，4 4,000rpm/min離心10min。同時在冰浴上配置TB溶液。4.棄上清，將離心管倒置于濾紙

21、上，使培養(yǎng)液被吸干。5.取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15ml TB（1/3體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10-15min，4 4,000rpm/min離心10min。6.棄上清，沉淀重懸于4ml TB（1/12.5體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10min。7.加入280lDMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴10min。8.將菌液分裝于EP管中，-80或液氮凍存。9.取兩管感受態(tài)細(xì)胞分別加入1l無菌ddH2O（陰性對照）和1l純質(zhì)粒（陽性對照）進(jìn)行轉(zhuǎn)化（見后），以檢測感受態(tài)的質(zhì)量。陰性對照平板上應(yīng)該無菌落生長，陽性對照平板上菌落數(shù)目的多少顯示感受態(tài)效率的高低。SOB的配制：蛋白

22、胨        20g酵母提取物    5gNaCl                0.58gKCl                  0.186g100×Mg+溶液  10ml溶解并加水定容至1L，121×20min高壓蒸汽滅菌100×Mg+溶液：        MgCl26H2O&#

23、160;     MgSO47H2O溶解并加水定容至100ml，121×20min高壓蒸汽滅菌TB溶液的配制：1M KCl                              5ml0.55M MnCl2                    2ml0.5MCaCl2      &#

24、160;                   0.6ml0.1M K-Pipes(pH 6.7)          2mlddH2O                          10.4mlTotal                 

25、             20ml注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：     稱取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此時粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固體調(diào)節(jié)PH值，只有當(dāng)PH接近6.7時粉末才能完全溶解，此時當(dāng)小心少量地加入KOH直至達(dá)到所需PH值。轉(zhuǎn) 化1.取100l感受態(tài)細(xì)胞于冰浴上融化。2.加入1l純質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物，輕輕吹打混勻，冰浴30 min。3.將菌液放入42水浴中熱激90秒，立即放入冰浴中2 min。4.加入0.9ml

26、SOC，于37恒溫?fù)u床上200rpm×1hr溫育。5.將菌液4000rpm/min離心3min，留200l上清將菌體打散，均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的瓊脂平板表面，平板于37倒置培養(yǎng)過夜。i.注：新倒的平板可于37培養(yǎng)箱中預(yù)先放置數(shù)小時至過夜干燥。ii.當(dāng)轉(zhuǎn)化的是TA克隆連接產(chǎn)物時可在菌液中加入8l 1M IPTG和40l20mg/ml X-gal以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。重組子的篩選和鑒定重組子可通過酶切進(jìn)行鑒定，也可以利用擴(kuò)增引物通過PCR進(jìn)行鑒定，陽性重組子能切出所需要的片段或得到相應(yīng)片段的PCR產(chǎn)物。1.用牙簽挑取平板上的菌落接種于2ml含適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37搖床培養(yǎng)過夜。2.

27、次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min離心，棄上清，加入20l ddH2O和20l酚/氯仿，震蕩混勻，13,000rpm×5min離心。3.取上清進(jìn)行瓊脂糖電泳，加入載體質(zhì)粒DNA作為陰性對照，根據(jù)質(zhì)粒大小初步篩選重組子，重組子的泳動速度應(yīng)該慢于載體質(zhì)粒。4.用堿法小量制備可能是重組子的質(zhì)粒DNA。5.選取適當(dāng)?shù)拿?，對重組子進(jìn)行酶切分析，酶切體積均為10l體系。酶切樣品進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。6.酶切分析正確的重組子分成兩份，一份進(jìn)行測序反應(yīng)，另外一份保種。7.若用PCR法鑒定，則在第2步時每個樣本取0.5-1.0l 菌液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，

28、每管反應(yīng)體系最低可少至10l，PCR產(chǎn)物電泳，能得到所需條帶的樣本進(jìn)一步提取質(zhì)粒酶切鑒定或送樣品測序。 TOP 發(fā)送短消息查看公共資料 查找該會員全部帖子· UID:754 · 精華: 2 · 威望:4 · 金幣:2787 元 · 元寶:468 個 · 貢獻(xiàn):108 點(diǎn) · 來自: · 注冊: 2008-10-09 狀態(tài): 離線 · 407827254 真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染該操作以Invitrogen公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE為例，其它轉(zhuǎn)染試劑可參照各自的使用說明書進(jìn)行。

29、1.      在6孔板中接種1-3×105細(xì)胞/孔，加入2ml完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37培養(yǎng)過夜。2.      待細(xì)胞長到50-80%單層時，在無菌離心管中配制如下溶液：i.溶液A：將1-2g待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到100l無血清培養(yǎng)基中ii.溶液B：將2-25lLipofectAMINE稀釋到100l無血清培養(yǎng)基中3.      混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15-45min。4.      用2ml無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞，加入0.8ml無血清培養(yǎng)基

30、/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中37孵育2-24hr。5.      用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)。6.      24-72hr后檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)或傳代并加入選擇性抗生素以篩選穩(wěn)定表達(dá)株。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選1確定抗生素作用的最佳濃度：不同的細(xì)胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗，確定抗生素對所選擇細(xì)胞的最低作用濃度。1)        提前24小時在96孔板或24孔板中接種細(xì)胞8孔，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO2孵箱中37培養(yǎng)過夜。

31、2)        將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000g/ml）。3)        培養(yǎng)10-14天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為400-800g/ml,篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時可比該濃度適當(dāng)提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半.2轉(zhuǎn)染按前面的步驟進(jìn)行。3轉(zhuǎn)染72小時后按1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6孔板中傳代，換為含預(yù)試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6孔板內(nèi)可見單個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個細(xì)胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時

32、可用兩種方法挑選單克隆。1)      濾紙片法：用消毒的5x5mm濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15秒，取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細(xì)胞在24孔板中長滿后轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶中,長滿后再轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。2)      有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋（10-210-10），將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96孔板中培養(yǎng)，7-10天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進(jìn)行克隆。4. ELISA或Western blot檢測單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此

33、可同時挑選多個克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種。重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、復(fù)性和定量按Qiagen公司的操作手冊進(jìn)行，具體步驟如下。一、重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)1.      挑取轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的單菌落，接種于3ml 選擇性LB液體培養(yǎng)基中，37 oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng)過夜。2.      次日將培養(yǎng)過夜的菌液500 l再接種于10 ml（1:20）選擇性LB液體培養(yǎng)基中，37 oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng)至光密度（OD600=0.6）時，取1 ml樣本作為誘導(dǎo)前標(biāo)本，10000g離心1 min收集菌體沉淀，20 oC凍

34、存?zhèn)溆谩?.      加入1 mol/L IPTG于菌液中，使IPTG終濃度為1 mM，37 oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng)45小時。取1 ml樣本作為誘導(dǎo)后標(biāo)本，同上法收集菌體沉淀，20 oC凍存?zhèn)溆谩?.      將誘導(dǎo)前后菌體沉淀用20 40 l PBS（pH= 8.0）重懸，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸加熱5 min，SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色3小時后，脫色觀察結(jié)果。5.      選取誘導(dǎo)成功的細(xì)菌克隆，擴(kuò)大誘導(dǎo)規(guī)模，收集菌體沉

35、淀，于20 oC保存，準(zhǔn)備做下一步分析及純化。二、重組蛋白質(zhì)的分離純化重組蛋白質(zhì)的可溶性鑒定1.      將按上法誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集的菌體重懸于裂解液1 (Lysis buffer under native conditions )中，然后在80 oC低溫冰箱中放置10 min。2.      冰中解凍。3.      在冰浴上用超聲破碎儀破菌6次，每次10 sec，間歇10 sec，電壓200-300 V。4.      10000g，4oC，離心20 min，取上清（為溶液

36、A），20 oC保存；另將沉淀用同樣裂解液1溶解（為溶液B），同樣20 oC保存，供后繼分析使用。5.      將上述A、B溶液和誘導(dǎo)前后的細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，比較分析重組蛋白質(zhì)的溶解性。如果誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)位于A溶液中，則為可溶性蛋白；如果是在B溶液中，則為非可溶蛋白。重組蛋白質(zhì)為非可溶性蛋白（變性條件下）的分離純化1.      將菌體沉淀溶于適量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions）中，室溫下攪拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。2.  

37、0;   10000g，4 oC，離心30 min，收集上清液。3.      將Ni-NTA Agarose充填柱子，并連接于Pharmarcia低壓液相層析系統(tǒng)，用5倍柱體積的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，調(diào)節(jié)A280值至零線。4.      將適量上清液上樣到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer沖洗至A280值低于0.01。5.      分別用510倍柱體積的清洗液1 和清洗液2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至A280值低于

38、0.01。6.      用洗脫液（Elution buffer）洗脫重組蛋白質(zhì)，在A280值監(jiān)測下，收集出現(xiàn)峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。三、重組蛋白質(zhì)的復(fù)性、凍干和定量純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析，最終用0.01×PBS透析，透析后的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，采用BIO-RAD公司蛋白質(zhì)定量試劑(protein assay)比色測定蛋白質(zhì)的含量。  TOP  發(fā)送短消息查看公共資料 查找該會員全部帖子· UID:754 · 精華: 2 · 威望:4 

39、3; 金幣:2787 元 · 元寶:468 個 · 貢獻(xiàn):108 點(diǎn) · 來自: · 注冊: 2008-10-09 狀態(tài): 離線 · 407827254 腫瘤細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)及保種一. 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)將液氮或-80oC保存的腫瘤細(xì)胞于37oC 水浴, 快速溶化, 用8.0ml培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液, 于1500轉(zhuǎn)/分, 離心3分鐘。棄上清, 再吸取8.0ml培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀, 再1500轉(zhuǎn)/分, 離心3分鐘, 棄上清, 細(xì)胞沉淀用1.0ml培養(yǎng)基混勻, 備用。 另取一個75cm2方瓶, 加入14.0ml培養(yǎng)基質(zhì), 將上述制備的含腫瘤

40、細(xì)胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37oC，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。若此腫瘤細(xì)胞懸浮生長, 大約34 天細(xì)胞基質(zhì)會變黃, 5.0ml細(xì)胞懸液可傳代一個方瓶培養(yǎng), 可用34個方瓶培養(yǎng), 一個方瓶中呈對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞可達(dá)11.5×107 個, 根據(jù)試驗所需, 可決定傳代的次數(shù)。 若此腫瘤細(xì)胞呈貼壁生長, 經(jīng)過34天, 腫瘤細(xì)胞生長至80%95% 單層時, 棄上清, 用0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細(xì)胞用0.25%胰酶1.0ml), 處理腫瘤細(xì)胞大約 35分鐘, 用倒置顯微鏡觀察，當(dāng)90% 的腫瘤細(xì)胞變圓時, 即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中, 于1500轉(zhuǎn)

41、/分下，離心3分鐘, 棄上清, 加少許培養(yǎng)基混勻, 可傳代3個75cm2方瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。二. 細(xì)胞凍存    將對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞用1個75cm2  方瓶按上述方法收集, 于1500轉(zhuǎn)/分 離心3分鐘,棄上清, 用保種液(含10% DMSO的小牛血清)3.0ml混勻, 分別加入到23只保種管中, 寫上腫瘤細(xì)胞名稱, 時間, 保種者姓名, 放-80o C 保存, 次日將它們轉(zhuǎn)移到液氮中保存(注: -80o C下可保存細(xì)胞半年至一年, 液氮可保存細(xì)胞510年, 甚至更長的時間)。以上所有物品均需經(jīng)過高溫滅菌( 121oC, 30分鐘)，培養(yǎng)基質(zhì)則經(jīng)過過濾(0.22uM)

42、除菌, 所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù), 避免細(xì)菌、真菌、病原體、衣原體等污染。腫瘤動物模型的建立將對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞收集, 用無血清基質(zhì)10.0ml, 于1500轉(zhuǎn)/分, 離心3min, 連續(xù)洗3次, 最后用無血清基質(zhì)混勻, 用血球計數(shù)器計算腫瘤細(xì)胞數(shù)量(平均5個中方格的細(xì)胞計數(shù)×104 即是腫瘤數(shù)/毫升)。 計算完腫瘤細(xì)胞總數(shù), 再將腫瘤細(xì)胞密度調(diào)至4×106 個/ml, 每只小鼠腋下接種50ul(即2×105個腫瘤細(xì)胞), 可接種C57和BALB/C 小鼠,a2周左右可捫及腫瘤小節(jié)結(jié)。一般選取68周的小鼠，不同的腫瘤細(xì)胞接種的數(shù)量和動物不一樣, 比如LL/2

43、, B16, Hep NS-1, EL-4, C26, Meth A可接種BALB/C 小鼠, H22接種昆明鼠。從腫瘤接種后可捫及小結(jié)節(jié)開始, 每3天用游標(biāo)卡尺量腫瘤縱橫大小(單位: mm), 至少連續(xù)一個月時間。注意要設(shè)計不同的實(shí)驗組和對照組, 每組動物數(shù)一般為510只, 一般接種腫瘤68周后，小鼠的腫瘤可生長至直徑為1520mm (即小鼠會瀕臨死亡)時, 可眼球取血，分離血清并保存血清, 處死小鼠, 取腫瘤組織照相, 取部分腫瘤組織作冰凍組織切片(或-80 保存), 作相應(yīng)的免疫組織化學(xué)染色, 取部分腫瘤組織用3%中性的甲醛固定, 石臘包埋, 作常規(guī)HE染色.小鼠尾靜脈注射方法在靠近實(shí)驗

44、臺邊緣處, 用大培養(yǎng)皿扣住小鼠, 左手抓住小鼠尾巴, 用酒精棉球擦尾巴, 可見到兩側(cè)靜脈; 注射前應(yīng)確認(rèn)針管內(nèi)無氣泡, 注射時由尾尖開始, 順向刺入。失敗后再逐漸移向根部重刺, 若準(zhǔn)確刺入靜脈內(nèi), 推進(jìn)時無阻力, 一般可注入0.10.5ml。腫瘤蛋白疫苗預(yù)防性動物實(shí)驗    一般腫瘤蛋白疫苗首次免疫劑量10ug/只小鼠, 與相應(yīng)佐劑混勻, 在背部皮下注射, 第2次免疫間隔2周, 同樣加佐劑在皮下注射； 第3次免疫間隔2周, 同樣加佐劑在皮下注射；第3次免疫后2周, 用ELISA檢測其血清效價，當(dāng)效價達(dá)到要求時；在接種腫瘤細(xì)胞前3天,于腹腔或尾靜脈加強(qiáng)注射20ug /只。人臍

45、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）培養(yǎng)1.    將15-20cm長的新生兒臍帶放入無菌的PBS溶液中儲存。（注：4下最多貯存24小時，室溫下不超過6小時，否則廢棄）2.    用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的PBS溶液沖洗3-5次，將污血沖洗干凈為止。3.    用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入15ml 的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化15-20分鐘，并不時上下?lián)u動臍帶。4.    消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個50 ml無菌離心管中，用無菌的PBS溶液沖洗臍帶2-3次。5.   

46、將收集液離心（2000轉(zhuǎn)/分）3分鐘。6.    倒去上清，加入10ml M199培養(yǎng)基（加入10U/ml的bFGF），用彎管吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37培養(yǎng)。（注：每個培養(yǎng)瓶中加入3-4ml無菌的1%的明膠溶液，搖勻使得明膠溶液完全鋪滿瓶底，放入37孵育，最少2小時，用前將明膠溶液倒了即可，明膠包被有利于細(xì)胞貼壁。）7.    培養(yǎng)24小時后，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入10 ml新鮮的 M199培養(yǎng)基。8.    以后每2天換一次培養(yǎng)基（每次換掉2/3的培養(yǎng)基）

47、。9.    一般培養(yǎng)5-7天，細(xì)胞可長滿至80-90%單層，這時可以傳代。10.    倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入2-3倍的有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。11.    用彎管將細(xì)胞吹打下來，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個50 ml無菌離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘。12.    倒掉上清,加入10ml新鮮培基,一般一瓶細(xì)胞可傳代3-4瓶.以后照此傳代培養(yǎng).13.    一

48、般傳代2-3代（培養(yǎng)了20天左右）用于做各種實(shí)驗效果最好。實(shí)驗動物免疫方案1、抗原: 蛋白質(zhì)、多肽、細(xì)胞器、細(xì)胞、組織等。2、免疫方式：皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、肌肉注射等。3、不同動物免疫所需抗原量（以蛋白免疫為例）>18-20kDa                  <18-20kDa動物    抗原量    最佳抗原量    抗原量    最佳抗原量兔子    20-200 

49、       100        50-400      200小鼠    2-40          15          4-60        40大鼠    10-50        30          20-15

50、0        50綿羊    100-1000      200        200-1000      400母雞    20-200        100          50-400      200單位：微克4、免疫方案（以免疫兔子為例）：天數(shù)    0 

51、;     14      28      38      56      66        87注射    x        x        x                x采血  2ml    &#

52、160;                   2ml          2+20ml    2+50-70ml5、注意：   ² 第一次免疫用完全佐劑與免疫原混合，以后加強(qiáng)免疫用不完全佐劑與免疫原混合，采取多點(diǎn)，時間間隔式免疫法。   ² 如果用細(xì)胞免疫兔子，那么每次免疫所需細(xì)胞量為2-3 x 107 cells。   ² 在連續(xù)免疫完三次后，需要

53、少量取血進(jìn)行ELISA檢測，檢測所免疫動物的抗體滴度，一般滴度能達(dá)到1:10,000-50,000。在處死所免疫的動物前一周應(yīng)加強(qiáng)一次免疫。 ²   如果用小鼠免疫，可以尾靜脈小量采血（大約50µl），最后取眼球大量采血（大約500-1000µl）；如果用兔子免疫，可以耳緣靜脈小量取血(大約2mL)，最后心臟大量取血(50-100mL) ²   按血清制備的標(biāo)準(zhǔn)方法將血清分離，并且分裝成小份，儲藏在-80oC。  TOP  發(fā)送短消息查看公共資料 查找該會員全部帖子· UID:754

54、· 精華: 2 · 威望:4 · 金幣:2787 元 · 元寶:468 個 · 貢獻(xiàn):108 點(diǎn) · 來自: · 注冊: 2008-10-09 狀態(tài): 離線 · 407827254 2009-08-24 17:49 | 只看樓主 樹型| 收藏| 評分 小 中 大 7# 血清制備1.取血后，37oC下，讓血液凝固1到2小時（不加抗凝劑）；2.4oC冰箱過夜（讓血塊固縮）；3.當(dāng)血清自然析出后， 4oC，3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，分離血清，棄去不溶物；4.將血清移至一干凈試管，并分裝成小份，儲藏在-80oC。ELI

55、SA一、包被抗原1.用50mM的碳酸鹽包被緩沖液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原濃度為10-20 g/ml，加100 l/孔到96孔酶標(biāo)板，4 oC放置過夜。2.第二天棄去包被液后，用PBST洗滌3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封閉1小時。3.PBST洗滌3次后，每孔加入100 l不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 oC孵育2小時。4.PBST洗滌5次后，加入100l稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37 oC孵育1小時。5.PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20 min后，酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。二、包被細(xì)胞1.在96孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為1 x 104 cells/well

56、，37過夜培養(yǎng)。2.第二天用PBS洗滌培養(yǎng)板2-3次。3.加入125 µl/well 10% Formalin（1:10稀釋）, 室溫下固定15 min。4.用ddH2O洗滌培養(yǎng)板3次，并晾干，儲藏在2-8oC備用。5.用PBST洗滌3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封閉1小時。6.PBST洗滌3次后，每孔加入100 l不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 oC孵育2小時。7.PBST洗滌5次后，加入100 l稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗,37 oC孵育1小時。8.PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20 min后，酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。50mM的碳酸鹽包被緩沖液：0

57、.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4，保存,Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。ABTS作為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)(10ml)：² 0.2M  Na2HPO  42.4ml² 0.1M  檸檬酸  2.6ml² ddH2O    5ml² ABTS        5mg² H2O2(30%)  4 ul（用前加入）注 意：²一般做倍比稀釋進(jìn)行檢測，需要有相應(yīng)的對照血清。²

58、不同的顯色系統(tǒng)對應(yīng)不同的光吸收值。血清學(xué)篩選克隆新抗原/新基因一、E.coli/ phage 裂解液預(yù)吸附血清1.將E.coli /phage lysate以1:10-20稀釋在TBST溶液中。2.將4張82mm的nitrocellulose membranes（NC）浸入稀釋后的E.coli/ phage lysate中，室溫下水平搖動30分鐘，取出NC并使膜瀝干。3.用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分鐘。4.用濾紙輕輕吸去膜上的液體。5.將膜放入50ml封閉液中，室溫下水平搖動最少30分鐘。6.將膜從封閉液中取出，用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分鐘。7.將血清按1:5

59、稀釋在TBST溶液中，將一張膜放入溶液中，37下輕輕水平搖動10分鐘。8.從血清稀釋液中取出膜并丟棄,加入另外一張新膜,37下輕水平搖10分鐘.9.重復(fù)步驟8，直至所有4張膜都處理完。10.除去最后一張膜，收集血清（primary antibody），分裝成小份儲存于-80冰箱中待用。注意：²該步處理過程是為了去除血清中能與細(xì)菌和噬菌體裂解蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)的抗體，這樣可以減少假陽性率；²一抗不能反復(fù)凍融，化凍后不要再次冰凍，可放于4作短暫保存；²可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，則需要至少10個病人血清進(jìn)行混合；二、噬菌體篩選1.準(zhǔn)備NZY aga

60、r plates（至少用前24小時倒好），用前在37培養(yǎng)箱中烘烤1-2小時以去除水滴。2.將過夜培養(yǎng)的XL1-blue MRF細(xì)菌2000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，將細(xì)菌溶解在10mM MgSO4中，調(diào)整細(xì)菌濃度為OD600=0.5。3.融化NZY top，并將NZY top放在50水浴中。4.將適量的XL1-blue MRF細(xì)菌溶液與一定稀釋度的phage文庫混合，37下共同作用15分鐘。²直徑90mm平板：200µl XL1-blue 細(xì)菌+適量的phage文庫²直徑150mm平板：600µl XL1-blue 細(xì)菌+適量的phag文庫（噬菌斑數(shù)量一般保

61、持在3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）5.將步驟4中的混合液與NZY top溶液混合（200µl混合液+3-4mlNZY top溶液；600µl混合液+8-10 ml NZY top溶液），倒入到NZY agar plates中，室溫下放10分鐘左右，然后倒置放于37下培養(yǎng)。6.當(dāng)噬菌斑剛好可看到時（大約5-8小時），從培養(yǎng)箱中拿出平板。7.將NC放入10mM IPTG溶液中完全浸濕，在空中使膜瀝干，并做好3個不對稱的標(biāo)記。8.將IPTG處理好的NC貼在平板上，不留氣泡，然后倒置放于37下培養(yǎng)。9.過夜培養(yǎng)后，第二天早上取出平板，用鑷子將膜輕輕掀起，

62、注意不要將培養(yǎng)基粘在膜上。10.將膜放于50ml TBST溶液中，水平脫色搖床上震蕩洗膜3次，每次10分鐘。11.將膜放入50ml封閉液中，水平搖動，封閉4-6小時。12.在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊囊豢?，水平搖動處理過夜。13.將膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分鐘。14.在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊亩梗ǜ鱾€公司的二抗使用滴度不同），室溫水平搖動1-2小時。15.將膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分鐘，最后用50ml TBS溶液洗膜15-20分鐘，取出膜空氣中瀝干。16.將膜放入BCIP-NBT顯色液中避光顯色，水平搖動直到陽性斑點(diǎn)可見為止。17.從顯色液中取出

63、膜放在TBS溶液中，空氣中使膜干燥。18.根據(jù)所做的標(biāo)記,將膜與平板對齊,將平板上對應(yīng)的陽性克隆區(qū)域的培養(yǎng)基挖出放入500µl SM buffer中,并加入25 ml chloroform,4貯存（最多可貯6月）。19.第一輪篩選得到陽性克隆需要進(jìn)行第二輪篩選以去除假陽性并獲得陽性單克隆噬菌體。過程如第一輪篩選，只不過用直徑90mm平板；具體過程見步驟4，這時所加入的噬菌體溶液是第一輪篩選得到的噬菌體上清（見步驟18），在用前要滴定好噬菌體的滴度，噬菌斑的數(shù)量以可區(qū)分出單個克隆，同時密度不能太稀為標(biāo)準(zhǔn)（一般100-200 pfu/90mm）。20.按第一輪相似的過程進(jìn)行實(shí)驗，最后顯色，確定真正的陽性克隆，并將陽性單克隆所在的培養(yǎng)基挖出放入500µl SM buffer中，并加入25 ml c