激光照射聯(lián)合復(fù)合多糖對荷瘤小鼠瘤增殖的影響

1、激光照射聯(lián)合復(fù)合多糖對荷瘤小鼠瘤增殖的影響    摘要  目的  探討低能量激光照射聯(lián)合龍葵多糖對荷肝癌小鼠腫瘤增殖的影響。方法  建立荷肝癌小鼠皮下種植瘤模型，將荷瘤小鼠隨機分為5組，連續(xù)治療10天后將小鼠處死。原位雜交法檢測瘤組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）mRNA表達；免疫組化法檢測瘤組織中細(xì)胞增殖核抗原Ki 67的表達。結(jié)果  低能量激光照射聯(lián)合龍葵多糖可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖及血管生成，顯著下調(diào)VEGF mRNA 、Ki 67的表達。結(jié)論  低能量激光照射聯(lián)合龍葵多糖能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成、

2、抑制荷肝癌小鼠腫瘤的生長。    關(guān)鍵詞  低能量激光照射；龍葵多糖； 增殖        Effects of laser irradiation solanum nigtum polysaccharide on tumor growth in cancer loaded mice        Abstract  Objective  To study effects of low energy las

3、er irradiation combined solanum nigtum polysaccarides on tumor growth in liver cancer loaded mice.Methods  Established liver cancer loaded mouse model and divided randomly mice into five groups.Then calculated the tumor inhibitory rate and spleen index.We detected the expression of VEGF mRNA by

4、 in situ hybridization and Ki 67 protein by immune histochemistry.Results  Low energy laser irradiation combined solanum nigtum polysaccharide could inhibit tumor growth and angiogenesis，the expression of VEGFmRNA，Ki 67 protein were decreased.Conclusion  Low energy laser irradiation combin

5、ed solanum nigtum polysaccharide can obviously inhibit the proliferation of liver cancer cells and angiogenesis，so inhibit the growth of the liver cancer in mice.        Key words  low energy laser irradiation；solanum nigtum polysaccharide；cells proliferation 

6、       本實驗用低能量激光照射聯(lián)合龍葵多糖來治療荷瘤小鼠，觀察其對腫瘤細(xì)胞增殖及血管生成的影響，以期探討低能量激光照射聯(lián)合龍葵多糖抑瘤作用的機制。        1  材料與方法        1.1  實驗材料        1.1.1  實驗藥物的配制  龍葵多糖：用純度為100%的龍葵多糖200 mg溶于生理鹽水50

7、 ml中，過濾除菌，4 保存。5-氟尿嘧啶（Fluorouracilum，5-FU）：0.25 g/10ml，南通制藥總廠生產(chǎn)。        1.1.2  細(xì)胞株  肝癌細(xì)胞H-22由北京大學(xué)腫瘤研究所引進。        1.1.3  實驗動物  昆明種小鼠50只，內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗中心購買。鼠齡為 45 wk，體重1822 g，雌雄各半。        1.2 

8、 實驗方法        1.2.1  肝癌細(xì)胞系復(fù)蘇培養(yǎng)  將肝癌細(xì)胞H-22復(fù)蘇，收集細(xì)胞放入生理鹽水1 ml中混勻，并等分兩份，取2只小鼠，每只腹腔注射肝癌細(xì)胞0.5 ml進行培養(yǎng)，1周后取小鼠腹水制備模型。        1.2.2  制備小鼠皮下荷瘤模型  取肝癌小鼠腹水約10 ml，用生理鹽水按12稀釋成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2.5×107個/ml，按0.2 ml/只接種于小鼠右腋皮下，將50只小鼠隨機分為五組。

9、（1）NS組：0.5 ml/(只·天)灌胃。（2）低能量激光照射組：激光照射小鼠10 min/(只·天)、劑量25.48 J/（cm2·只·天)。（3）龍葵多糖組：2 mg /0.5 ml/(只·天)灌胃。(4)低能量激光照射聯(lián)合龍葵多糖組：激光照射小鼠10 min/(只·天)、劑量25.48 J/(cm2·只·天)、龍葵多糖2 mg/（0.5ml·只·天)灌胃。（5）5-FU組：0.25 mg/（0.5 ml·只·天)灌胃。采用南京激光儀器廠產(chǎn)JD-型激光器，輸出功率12

10、mW，波長632.8 nm，光斑直徑0.6 cm。從接種瘤細(xì)胞24 h后（2）、（4）組用激光照射小鼠脾區(qū)(脫毛)，激光照射距離30 cm，每日1次，每次照射10 min，同時各藥物組相應(yīng)灌胃給藥，照射、給藥10次結(jié)束后24 h處死小鼠。        1.2.3  病理組織學(xué)觀察  處死荷瘤鼠后30 min內(nèi)取瘤組織、脾臟等臟器，10%中性甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，5 m切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下低倍、高倍觀察。        1.2.4 

11、原位雜交法檢測瘤細(xì)胞VEGF mRNA表達  采用VEGF mRNA原位雜交試劑盒，檢測瘤組織VEGF mRNA表達。        1.2.5  免疫組化法檢測瘤組織Ki 67抗原表達  采用免疫組化S-P法檢測。按照試劑盒說明書進行操作。        1.3  統(tǒng)計學(xué)方法  實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗。      

12、  2  結(jié)果        2.1  腫瘤組織切片光鏡觀察  NS組腫瘤細(xì)胞數(shù)增多，呈異質(zhì)性，核大深染，出現(xiàn)較多核分裂象，可見血管形成增多。激光照射聯(lián)合龍葵多糖組瘤細(xì)胞減少，細(xì)胞體積縮小，有較多的核固縮，淋巴細(xì)胞浸潤，血管形成明顯減少。        2.2  原位雜交法檢測瘤細(xì)胞VEGF mRNA的表達  VEGF mRNA陽性反應(yīng)胞漿呈棕黃色。圖像分析系統(tǒng)對各組瘤細(xì)胞VEGF mRNA表達進行平均灰度值統(tǒng)計。結(jié)

13、果顯示激光照射聯(lián)合龍葵多糖組較NS組明顯減弱，聯(lián)合組與激光照射組、龍葵多糖組相比也有所減弱。見表1。表1  瘤細(xì)胞中VEGF mRNA陽性表達的平均  灰度值統(tǒng)計  （n=10，x±s ） 注：與NS組相比，P0.01；與激光聯(lián)合龍葵多糖組相比，P0.05    2.3  免疫組化法檢測瘤細(xì)胞Ki 67表達  計數(shù)采用Ki 67指數(shù)1，即每個標(biāo)本低倍鏡 (×100)下觀察，選擇5個視野;高倍鏡 (×400)下每個視野選取200個腫瘤細(xì)胞，計算其陽性細(xì)胞總數(shù)。Ki 67陽性為細(xì)

14、胞核染色呈棕黃色，陰性對照片（PBS為一抗）無棕黃色著色。實驗組與NS組相比Ki 67值明顯減少，聯(lián)合組與龍葵多糖組、激光照射組相比也明顯減少。見表2。表2  各組小鼠腫瘤細(xì)胞Ki 67指數(shù)  （n=10，x±s） 注：與生理鹽水組比較，P0.01；與激光聯(lián)合龍葵多糖組比較，P0.05   3  討論      激光照射部位越接近免疫器官，或該處神經(jīng)組織越密集，對機體免疫功能影響就越為明顯2。從龍葵中提取的抗癌活性物質(zhì)龍葵多糖有較好的抑瘤作用，本研究應(yīng)用龍葵多糖與激光的生物學(xué)

15、療法聯(lián)合作用來提高抗腫瘤效果。腫瘤血管形成在腫瘤的演化過程中起著非常重要的作用，腫瘤通過血管從宿主獲得豐富的營養(yǎng)和氧，并通過血管向宿主輸送大量惡性細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤的不斷生長和轉(zhuǎn)移，因此腫瘤血管新生是惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的前提。在較多誘導(dǎo)實體腫瘤血管生長的因子中，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）被認(rèn)為是最重要的血管形成因子，也是高度特異和高效的血管調(diào)控因子，多種實體瘤細(xì)胞分泌VEGF，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)3。VEGF是一種多功能細(xì)胞因子，能選擇性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的兩種酪氨酸激酶受體，具有促進內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和血管構(gòu)建的作用，能夠提高微血管對大分子物質(zhì)的通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)

16、胞產(chǎn)生蛋白溶酶、誘導(dǎo)間質(zhì)膠原酶和組織因子的表達，改變細(xì)胞外基質(zhì)，使其更易于血管的生長4。本實驗結(jié)果表明低能量激光照射聯(lián)合龍葵多糖可以抑制腫瘤細(xì)胞中VEGF的生成，導(dǎo)致血管生成的環(huán)節(jié)受到抑制，腫瘤組織血管生成減少，阻斷腫瘤生長所需營養(yǎng)，抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移。細(xì)胞增殖抗原Ki 67是目前應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記抗原之一，是和細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原，表達于細(xì)胞核內(nèi)，能很好地反映細(xì)胞增殖活性，其檢測結(jié)果較半衰期較長的PCNA更準(zhǔn)確5。本實驗結(jié)果表明未給予任何抗癌藥物的NS組瘤細(xì)胞Ki 67表達增強，細(xì)胞增殖活性增高，瘤組織增殖旺盛。激光照射聯(lián)合多糖組瘤細(xì)胞Ki 67表達減弱，瘤細(xì)胞增殖受

17、到抑制，導(dǎo)致腫瘤的生長被抑制?？傊湍芰考す庹丈渎?lián)合龍葵多糖能夠減少腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。關(guān)于激光和龍葵多糖抑瘤作用的研究還不夠深入，許多問題還有待于進一步研究。參考文獻    1  Nolte M，Werner M，Nasarek A，et al.Expression of proliferation associated antigens and detection of numerical chromosome aberrations in primary human liver tumors: relevance to tumor characteristics and prognosis.J Cli Pathol，1998，51(1):47-51.    2  高美華，李武修，馮獻啟，等.激光照射對荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞活性的影響.中國激光，2002，4（29）：381-382.    3  Senger DR.Molecular framework for angiogenesis.Am J Pathol，1996，149:1-10.    4  Yoshiji H，Kuriyama S，Hicklin