PCR常見問題及解決方案精品課件

1、PCRPCR常見問題、原因分析及其對(duì)策常見問題、原因分析及其對(duì)策12021/8/232PCR技術(shù)簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介PCR常見問題、原因分析及其解決方案常見問題、原因分析及其解決方案提高提高PCR反應(yīng)特異性的策略反應(yīng)特異性的策略主講內(nèi)容主講內(nèi)容PCR技術(shù)簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介3 DNA模板模板 引物引物 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 dNTP ddH2O 耐熱聚合酶耐熱聚合酶4反應(yīng)體系對(duì)反應(yīng)體系對(duì)PCRPCR擴(kuò)增的影響擴(kuò)增的影響DNA模板模板純度純度 蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會(huì)抑制蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會(huì)抑制PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)完整性完整性 模板降解會(huì)導(dǎo)致模板降解會(huì)導(dǎo)致PCRPCR擴(kuò)增無產(chǎn)物擴(kuò)增無產(chǎn)物濃度濃度 加量過多導(dǎo)

2、致非特異性擴(kuò)增增加加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加特異性特異性 長度適當(dāng)長度適當(dāng)、避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體完整性完整性 避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融濃度濃度 應(yīng)適當(dāng)應(yīng)適當(dāng), ,過高導(dǎo)致非特異性增加過高導(dǎo)致非特異性增加, ,過低則過低則引引 物物擴(kuò)增產(chǎn)物太少擴(kuò)增產(chǎn)物太少5反應(yīng)體系對(duì)反應(yīng)體系對(duì)PCRPCR擴(kuò)增的影響擴(kuò)增的影響反應(yīng)反應(yīng) pH值值, ,鹽離子濃度鹽離子濃度穩(wěn)定劑穩(wěn)定劑, ,增強(qiáng)劑增強(qiáng)劑Mg 2濃度濃度過高非特異性嚴(yán)重過高非特異性嚴(yán)重過低無擴(kuò)增產(chǎn)物過低無擴(kuò)增產(chǎn)物濃度適當(dāng)濃度適當(dāng)避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融ddH2OpH值適當(dāng)值適當(dāng)避免污染避免污染6 DNA模板模板 引物引物 反應(yīng)緩沖

3、液反應(yīng)緩沖液 Mg 2 dNTP ddH2O 耐熱聚合酶耐熱聚合酶7如何選擇如何選擇的的DNA聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶的特性聚合酶的特性 PCR 實(shí)驗(yàn)的不同需求實(shí)驗(yàn)的不同需求8如何選擇如何選擇的的DNA聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶的特性聚合酶的特性純純 度度穩(wěn)定性穩(wěn)定性酶活性酶活性9如何選擇如何選擇的的DNA聚合酶聚合酶 PCR 實(shí)驗(yàn)的不同需實(shí)驗(yàn)的不同需求求長片段擴(kuò)增長片段擴(kuò)增PCR試劑盒試劑盒 擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率 保保 真真 性性 特特 異異 性性 基因組擴(kuò)增、RT-PCR 基因篩選、測(cè)序、 基因克隆 復(fù)雜模板擴(kuò)增（GC含量高、二級(jí)結(jié)構(gòu)）構(gòu)建基因圖譜、測(cè)序、分子遺傳學(xué) 復(fù)雜模板擴(kuò)增、大規(guī)模

4、基因檢測(cè)10特異性特異性 熱啟動(dòng)熱啟動(dòng) Taq酶酶原原 理理 蠟封蠟封 抗體抑制抗體抑制 化學(xué)修飾化學(xué)修飾特特 點(diǎn)點(diǎn) 避免非特異性擴(kuò)增避免非特異性擴(kuò)增 提高提高PCR反應(yīng)的反應(yīng)的特異性特異性用用 途途 基因組擴(kuò)增基因組擴(kuò)增 RT-PCR11 熱啟動(dòng)熱啟動(dòng) Taq酶酶特異性特異性產(chǎn)產(chǎn) 品品 類類 型型產(chǎn)產(chǎn) 品品 名名 稱稱產(chǎn)產(chǎn) 品品 性性 能能化學(xué)修飾化學(xué)修飾 天為時(shí)代天為時(shí)代: HotStart Taq Roche : FastStart Taq Abgene: Thermo-start DNA Polymerase Stratagene: SureStart Taq 大大提高大大提高PCRP

5、CR反應(yīng)的特異性反應(yīng)的特異性 化學(xué)修飾不影化學(xué)修飾不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)響后續(xù)實(shí)驗(yàn)抗體抑制抗體抑制 Invitrogen： AccuPrimeTM Taq Platinum Taq TaKaRa： ExTaqTM HotStart Version 蠟封蠟封 Promega：TaqBeadTM HotStart 12保真性保真性 高保真酶高保真酶原原 理理用用 途途 35核酸核酸 表達(dá)基因的克隆表達(dá)基因的克隆基因的定點(diǎn)突變基因的定點(diǎn)突變 細(xì)胞內(nèi)基因點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)基因點(diǎn)突變分析突變分析（SNPSNP） 外切酶活性外切酶活性 降低堿基錯(cuò)配率降低堿基錯(cuò)配率 13保真性保真性 高保真酶高保真酶產(chǎn)產(chǎn) 品品 類類 型型生

6、生 物物 公公 司司性性 能能 比比 較較PfuDNA Polymerase 天為時(shí)代天為時(shí)代 Stratagene Promega在目前已發(fā)現(xiàn)的所有在目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐熱聚合酶中耐熱聚合酶中, Pfu, Pfu保保真度最高堿基錯(cuò)配率真度最高堿基錯(cuò)配率最低最低PyrobestTM DNA Polymerase TaKaRaTli DNA PolymerasePromega14 高保真高保真 高擴(kuò)增效率高擴(kuò)增效率原原 理理 混合酶混合酶高擴(kuò)增效率高擴(kuò)增效率 35核酸外切核酸外切用用 途途 超長片段擴(kuò)增超長片段擴(kuò)增 測(cè)序測(cè)序 構(gòu)建基因圖譜構(gòu)建基因圖譜 復(fù)雜模板擴(kuò)增復(fù)雜模板擴(kuò)增GC含量高含量高二級(jí)結(jié)

7、構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)15 高保真高保真 高擴(kuò)增效率高擴(kuò)增效率特特 點(diǎn)點(diǎn) 產(chǎn)產(chǎn) 品品性性 能能高擴(kuò)增效率高擴(kuò)增效率天為時(shí)代天為時(shí)代：Taq Plus TaKaRa：Ex TaqTM 復(fù)雜模板擴(kuò)增復(fù)雜模板擴(kuò)增高保真高保真天為時(shí)代天為時(shí)代： Taq Platinum Invitrogen：Pfx Platinum Taq High Fidelity 保真度低于保真度低于PfuPfu聚合酶聚合酶但擴(kuò)增效率較高但擴(kuò)增效率較高 長片段擴(kuò)增長片段擴(kuò)增天為時(shí)代天為時(shí)代：Long Taq TaKaRa：LA Taq Invitrogen：Elongase Amplificaiton System 特別適用于保真度較特別適

8、用于保真度較高的高的 超長片段擴(kuò)增超長片段擴(kuò)增16PCR MasterMix原原 理理預(yù)配好的預(yù)配好的PCR反應(yīng)反應(yīng)液液 DNA聚合酶聚合酶 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 dNTPdNTP PCR增強(qiáng)劑增強(qiáng)劑 17PCR Master Mix特特 點(diǎn)點(diǎn) 快速簡(jiǎn)便快速簡(jiǎn)便 減少加樣誤差和污染減少加樣誤差和污染 靈敏度高靈敏度高 可擴(kuò)增低至可擴(kuò)增低至2 2個(gè)拷貝的目的模板個(gè)拷貝的目的模板 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) 降低降低PCRPCR反應(yīng)的要求，反應(yīng)的要求，增強(qiáng)特異性增強(qiáng)特異性 穩(wěn)定性好穩(wěn)定性好 長期放置活性無改變長期放置活性無改變適用范圍適用范圍 大規(guī)?；驒z測(cè)大規(guī)模基因檢測(cè) 目的基因拷貝數(shù)極低的樣本目的基因拷

9、貝數(shù)極低的樣本 GC含量高含量高, ,有二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板有二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板 復(fù)雜基因組樣本復(fù)雜基因組樣本 可直接檢測(cè)菌落，基因點(diǎn)突變檢測(cè)可直接檢測(cè)菌落，基因點(diǎn)突變檢測(cè), , 或者陽性克隆的篩選。或者陽性克隆的篩選。18PCR技術(shù)簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介PCR常見問題、原因分析及其解決方案常見問題、原因分析及其解決方案提高提高PCR反應(yīng)特異性的策略反應(yīng)特異性的策略PCR常見問題、原因分析及其解決方案常見問題、原因分析及其解決方案19 無擴(kuò)增產(chǎn)物 非特異性擴(kuò)增 拖尾 假陽性20無擴(kuò)增產(chǎn)物模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低BufferBuffer對(duì)樣品不合適對(duì)樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降引物設(shè)計(jì)

10、不當(dāng)或者發(fā)生降解解反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：退火溫度太高，延退火溫度太高，延伸時(shí)間太短伸時(shí)間太短 原原因因?qū)?duì)策策純化模板或者使用試劑盒提取純化模板或者使用試劑盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量更換更換BufferBuffer或調(diào)整濃度或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物管新引物降低退火溫度、延長延伸時(shí)間降低退火溫度、延長延伸時(shí)間現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無正對(duì)照有條帶，而樣品則無；21 非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象：現(xiàn)象：PCRPCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的

11、大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶?；蛐。蛘咄瑫r(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。22引物特異性差引物特異性差模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高酶量過多酶量過多MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高退火溫度偏低退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因?qū)?duì)策策重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式式PCRPCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴(kuò)增23 拖尾 現(xiàn)象：現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈產(chǎn)物在凝膠

12、上呈Smear狀態(tài)狀態(tài)。 M 1 224模板不純模板不純BufferBuffer不合適不合適退火溫度偏低退火溫度偏低酶量過多酶量過多dNTPdNTP、MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因?qū)?duì)策策純化模板純化模板更換更換BufferBuffer適當(dāng)提高退火溫度適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適量用酶適當(dāng)降低適當(dāng)降低dNTPdNTP和鎂離子的和鎂離子的濃度濃度減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 拖尾25 假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況) ) 原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增

13、產(chǎn)物 對(duì)策：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。 26PCR技術(shù)簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介PCR常見問題、原因分析及其解決方案常見問題、原因分析及其解決方案提高提高PCR反應(yīng)特異性的策略反應(yīng)特異性的策略提高提高PCR反應(yīng)特異性的策略反應(yīng)特異性的策略27巢式巢式PCR（Nes

14、t-PCR） 遞減遞減PCR（TouchDown PCR） 熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)PCR（HotStart PCR） 使用使用PCR增強(qiáng)劑增強(qiáng)劑28巢式巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗟氖褂媒档土藬U(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。套引物都互補(bǔ)的靶序列很少。 巢式巢式PCR可以增加有限量靶序列可以增加有限量靶序列（如稀有如稀有mRNA）的靈敏度，的靈敏度，并且提高了困難并且提高了困難PCR（如如5 RACE）的特異性。）的特異性。 29遞減遞減PCR（TouchDown PCR） 遞減遞減PCR通過在通過在P

15、CR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的TmTm高大約高大約5的退火溫度下開始，的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低然后每個(gè)循環(huán)降低1 1-2 2, ,直到退火溫度低于直到退火溫度低于Tm Tm 5。 特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。 遞減遞減PCR對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。指紋分析等。30

16、熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)PCR （HotStart PCR） 熱啟動(dòng)主要是通過抑制一種基本成分延遲熱啟動(dòng)主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，合成，直到直到PCR 儀達(dá)到變性溫度；儀達(dá)到變性溫度； 現(xiàn)在有很多公司都有現(xiàn)在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，該酶具有熱酶出售，該酶具有熱啟動(dòng)的性能，使用簡(jiǎn)單方便，適合于高通量應(yīng)用啟動(dòng)的性能，使用簡(jiǎn)單方便，適合于高通量應(yīng)用； 熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異特異性最重要的方法之一。性最重要的方法之一。31使用使用PCR增強(qiáng)劑增強(qiáng)劑 甲酰胺，甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等都可充當(dāng)，甘油，甜菜堿等都

17、可充當(dāng)PCR的增強(qiáng)劑。的增強(qiáng)劑。 其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助助DNA聚合酶延伸通過二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)聚合酶延伸通過二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。 增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng)增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng) 32謝謝！謝謝！ 本公司產(chǎn)品江蘇地區(qū)特約代理本公司產(chǎn)品江蘇地區(qū)特約代理南京天為生物科技有限公司南京天為生物科技有限公司聯(lián)系電話：聯(lián)系電話84705301 84701501025-86073713 84705301 847015012424小時(shí)服務(wù)熱線：小時(shí)服務(wù)熱線：1305758517713057585177 聯(lián)系人：王彤聯(lián)系人：王彤免費(fèi)技

18、術(shù)支持：免費(fèi)技術(shù)支持：800 810 217733l9、 人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。22.2.922.2.9Wednesday, February 09, 2022l10、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*2/9/2022 5:54:04 AMl11、人總是珍惜為得到。22.2.9*Feb-229-Feb-22l12、人亂于心，不寬余請(qǐng)。*Wednesday, February 09, 2022l13、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。22.2.922.2.9*February 9, 2022l14、抱最大的希望，作最大的努力。2022年2月9日星期三*22.2.9l15、一個(gè)人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。2022年2月*22.2.9*February 9, 2022l16、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。*2/9/2022l17、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。*22.2.9謝謝大家謝謝大家34l9、 人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。22.2.922.2.9Wednesday, February 09, 2022l10、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*2/9/2022 5:54:04 AMl11、人總是珍惜為得到。22.2.9*Feb-229-Feb-22l12