免疫膠體金法快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留的研究

1、免疫膠體金法快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留的研究張燕王瑋劉俊偉王碩(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院天津市食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津300457摘要目的:優(yōu)化建立滲濾式(Flow through 和側(cè)流式(Lateral flow 兩種金標(biāo)記免疫競(jìng)爭(zhēng)快速篩選方法。方法:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,標(biāo)記氯霉素多克隆抗體,以硝酸纖維素膜為載體,包被氯霉素半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物作為檢測(cè)帶,經(jīng)過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)后目測(cè)結(jié)果。結(jié)果:通過(guò)簡(jiǎn)單的樣品前處理方法,消除了基質(zhì)影響,可成功用于豬肉、雞肉和鱈魚(yú)樣品中痕量氯霉素殘留的快速檢測(cè)。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液及組織試樣的提取稀釋液時(shí),靈敏度分別為0.8g/L 和1g/

2、L 。幾種氯霉素的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物及常見(jiàn)獸藥對(duì)氯霉素檢測(cè)均無(wú)干擾,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附定量檢測(cè)方法驗(yàn)證了2種快速篩選方法的有效性,加速穩(wěn)定性試驗(yàn)證明滲濾式金標(biāo)試紙條在4下6個(gè)月內(nèi)可保持檢測(cè)結(jié)果的可靠性。結(jié)論:所建立的方法操作簡(jiǎn)單,快速,靈敏度高,穩(wěn)定性好,可作為動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留現(xiàn)場(chǎng)大量篩選的有效手段。關(guān)鍵詞氯霉素膠體金滲濾式側(cè)流式文章編號(hào)1009-7848(200901-0196-05氯霉素(chloramphenicol ,CAP 是一種高效廣譜抗生素,常用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療1,但氯霉素對(duì)人體有嚴(yán)重的毒副作用24。目前美國(guó)和歐共體已禁止在食用性動(dòng)物中使用氯霉素,并規(guī)定在動(dòng)物源性食品中不

3、得檢出。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2002年12月第235號(hào)公告動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量中規(guī)定氯霉素為禁用藥物,在動(dòng)物性食品中不得檢出。因此,發(fā)展快速靈敏的檢測(cè)技術(shù)已成為氯霉素殘留檢測(cè)的研究焦點(diǎn)。1971年Faulk 和Taylor 5將膠體金應(yīng)用于免疫化學(xué)中,使膠體金在生物醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)80年代末期,人們把膠體金免疫技術(shù)與固相膜結(jié)合,建立了膠體金免疫快速檢測(cè)方法。目前常見(jiàn)的檢測(cè)形式有:滲濾式(Flow through 和側(cè)流式(Lateral flow 6。本文研究2種膠體金標(biāo)記試紙條,用于豬肉、雞肉及鱈魚(yú)中的氯霉素殘留的快速檢測(cè),可作為現(xiàn)場(chǎng)大量樣品快速篩選的

4、有效工具。1材料與方法1.1材料Linomat 5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀,瑞士Camag ;酶標(biāo)測(cè)定儀,美國(guó)Thermo ;CARY 50Bio 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),美國(guó)Varian ;Milli-Q 純水發(fā)生器,美國(guó)Millipore ;硝酸纖維素膜,美國(guó)Pierce ,catalogno.88018;Hi-flow plus 型纖維素膜及墊片,美國(guó)Millipore ,part no.HF090MC100;吸收墊,美國(guó)Millipore ,part no.CFSP223000;氯金酸(HAuC 14·4H 2O ,分析純,上?；瘜W(xué)試劑有限公司;氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白(BSA 、卵清蛋

5、白(OVA 、辣根過(guò)氧化物酶和羊抗兔二抗,美國(guó)Sigma 公司。膠體金透射電鏡掃描由天津師范大學(xué)電鏡室完成。氯霉素半抗原、抗體、包被抗原(CAP-OVA 、酶標(biāo)抗原,天津科技大學(xué)食品安全研究室自制78。金標(biāo)抗體儲(chǔ)存液:0.3814g 硼酸鈉,0.5g BSA 和0.5g 疊氮鈉(NaN 3,溶于500mL 二次水;0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS pH 7.4;包被液:pH 9.6碳酸鹽緩沖溶液;封閉液:1%BSA-PBS ;洗滌液:PBST (含0.05%Tween-20的PBS ;顯色底物溶液:TMB/H 2O 2;終止液:1.25mol/L 硫酸;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。收?/p>

6、日期:2008-02-27基金項(xiàng)目:國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2006BAD05A06作者簡(jiǎn)介:張燕,女,1970年出生,副教授通訊作者:王碩Vol.9No.1Feb .2009Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology中國(guó)食品學(xué)報(bào)第9卷第1期2009年2月第9卷第1期1.2試驗(yàn)方法1.2.1膠體金及抗體標(biāo)記物的制備采用檸檬酸三鈉還原法9制備膠體金。膠體金溶液自然冷卻后,用0.1mol/L K2CO3調(diào)節(jié)其pH至9.0,在磁力攪拌下,向20mL膠體金溶液中逐滴加入336g抗體,10min后逐滴加入10%的BSA,

7、使溶液中BSA 的終含量為1%,攪拌30min后置于4過(guò)夜。1500r/min離心10min,取上清液于4、10000 r/min離心30min,棄上清液。用儲(chǔ)存液溶解膠體金至1mL,重復(fù)上一步離心步驟,棄上清,膠體金用儲(chǔ)存液重懸至原體積的1/10,4保存。1.2.2試紙條的制備以硝酸纖維素膜為固相載體,每條帶包被CAP-OVA1g作為檢測(cè)帶(Test zone,T帶;每條帶包被羊抗兔二抗0.5g作為質(zhì)控帶(Control zone,C帶,T帶與C帶間隔3mm。先將硝酸纖維素膜裁成一定大小(滲濾式0.7cm×1.5cm,側(cè)流式0.5cm×2cm,再置于37恒溫箱中固定15m

8、in,經(jīng)封閉液封閉30min,PBST沖洗3次,37干燥后4保存。1.2.3試紙條的組裝6滲濾式形式(見(jiàn)圖1:用水將濾紙潤(rùn)濕后緊貼在惰性塑料底板上,再把試紙條正面朝上緊貼在濕潤(rùn)的濾紙上,加樣時(shí)另取一張干凈的濾紙?jiān)谶吘壩源龠M(jìn)樣液的滲濾。側(cè)流式形式(見(jiàn)圖2:將吸水板裁剪成同側(cè)流式膜的寬度,粘貼在膜的上端(與膜有部分重疊,壓緊,裝入帶有干燥劑的密封筒中,于4保存。圖1金標(biāo)記滲濾式分析裝置示意圖Fig.1Schematic diagram of the analytical device for Flow through immunogold assay圖2金標(biāo)記Lateral flow分析裝置示

9、意圖Fig.2Schematic diagram of the analytical device for Lateral flow immunogold assay1.2.4競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)滲濾式形式:將金標(biāo)記抗體(經(jīng)連接儲(chǔ)備緩沖液12稀釋與含CAP的待測(cè)液按13的體積比例(30L+90L混合均勻,取100L混合液加入包被有半抗原的區(qū)域。待液體完全滲透過(guò)膜上的反應(yīng)區(qū)后,在C帶顯色的前提下,目視T帶的顏色,與空白對(duì)照,顏色越淺,代表CAP 含量越高。倒流式形式:將金標(biāo)記抗體(經(jīng)連接儲(chǔ)備緩沖液12稀釋與含CAP的待測(cè)液按14的體積比例(20L+80L混合均勻,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(不含CAP,將組裝好的試紙條

10、分別浸入相應(yīng)的混合液中,反應(yīng)5min后與陰性對(duì)照,結(jié)果判定同上。1.2.5最低檢出限的確定將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品用含5%甲醇的PBST溶液稀釋成系列梯度:0.1、0.5、0.8、1、10、50g/L,取上述梯度稀釋液與膠體金標(biāo)記抗體按比例混合后再與包被原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),以能與空白對(duì)照有明顯色差的最小濃度為檢出限。1.2.6樣品(豬肉、雞肉、鱈魚(yú)預(yù)處理稱(chēng)取試樣2g置于樣品瓶中,加入4mL甲醇,旋渦振蕩2免疫膠體金法快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留的研究197中國(guó)食品學(xué)報(bào)2009年第1期min,過(guò)濾。1.2.7樣品基質(zhì)影響的消除將陰性樣品(經(jīng)液相驗(yàn)證不含CAP處理液用PBST稀釋5、10、15、20倍,同時(shí)

11、將甲醇用同樣的方法稀釋作為空白對(duì)照,進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)?；|(zhì)稀釋液與相應(yīng)空白對(duì)照的檢測(cè)帶顏色相同時(shí)判斷基質(zhì)影響消除。1.2.8交叉反應(yīng)選擇氯霉素琥珀酸鈉、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氨卞西林和磺胺二甲基嘧啶5種藥物,分別配成系列濃度,用2種檢測(cè)方法分別進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。1.2.9有效性的驗(yàn)證選擇豬肉樣品(經(jīng)液相檢測(cè)不含氯霉素做氯霉素添加檢測(cè)試驗(yàn),樣品處理方法見(jiàn)本文1.2.6節(jié),同時(shí)采用酶聯(lián)免疫定量分析法和膠體金試紙條方法進(jìn)行檢測(cè),判斷檢測(cè)結(jié)果的一致性。定量方法:在96孔酶標(biāo)板上用包被液包被抗體(1g/孔,室溫孵育過(guò)夜。用PBST洗板3次,封閉液封閉1h。棄封閉液后,再用PBST洗板3次。加入不同濃度的CAP標(biāo)

12、準(zhǔn)液或樣品稀釋液100L/孔和酶標(biāo)抗原100L/孔,室溫孵育1h。洗板后加底物液150L/孔,室溫顯色30min,加終止液(1.25mol/L濃硫酸50L/孔,終止反應(yīng),酶標(biāo)儀讀數(shù),測(cè)450nm處吸光值(參考波長(zhǎng)為650nm。1.2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)將試紙條和金標(biāo)記抗體分裝后置于37做穩(wěn)定性試驗(yàn)。在第1、3、5、7天時(shí)分別取出,進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),觀察顏色的變化。2結(jié)果與討論2.1膠體金的制備檸檬酸三鈉還原法制備膠體金時(shí),應(yīng)迅速地一次性加入還原劑,不要逐滴或間斷加入,否則易使制得的金顆粒大小不均,形成聚合物,從而使膠體溶液不穩(wěn)定。本試驗(yàn)中制備的膠體金狀態(tài)為澄清的紅色溶液,表面無(wú)漂浮物,說(shuō)明無(wú)聚合物產(chǎn)生

13、。對(duì)自然冷卻后的膠體金溶液利用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)在可見(jiàn)光范圍(400600nm內(nèi)進(jìn)行掃描,得到單一的吸收峰,最大吸收峰波長(zhǎng)為522.0 nm。經(jīng)透射電鏡掃描,膠體金顆粒均勻,平均粒徑為20nm。2.2檢出限的確定通過(guò)對(duì)半抗原偶聯(lián)物的包被量、金標(biāo)記抗體的稀釋比例、金標(biāo)記抗體與待測(cè)液混合比例等條件的優(yōu)化,建立了滲濾式和側(cè)流式2種檢測(cè)形式。用這2種檢測(cè)形式對(duì)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,當(dāng)CAP質(zhì)量濃度低于0.8g/L時(shí),滲濾式檢測(cè)帶的顏色與空白對(duì)照無(wú)法通過(guò)目測(cè)區(qū)別;大于或等于0.8g/L時(shí)可分辨出顏色差別,因此確定滲濾式試紙條對(duì)氯霉素的檢出限為0.8g/ L。用同樣的方法確定側(cè)流式試紙條的

14、檢出限為1g/L。隨著氯霉素的濃度升高,兩種方法檢測(cè)帶的顏色均逐漸變淺,說(shuō)明在一定范圍內(nèi)該方法可有效檢測(cè)氯霉素殘留量。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。注:氯霉素質(zhì)量濃度從左至右分別為:0、0.8、10、50g/L。圖3滲濾式試驗(yàn)結(jié)果Fig.3Result of the Flow through assay 198第9卷第1期2.3樣品基質(zhì)影響的消除將樣品提取液用PBST稀釋不同倍數(shù)后做競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn),當(dāng)檢測(cè)帶與空白對(duì)照顏色相同時(shí)視為基質(zhì)影響消除。經(jīng)過(guò)5次重復(fù)試驗(yàn),確定了豬肉、雞肉、鱈魚(yú)3種基質(zhì)的稀釋倍數(shù)分別為10、10、5倍。本試驗(yàn)樣品處理方法簡(jiǎn)便,3種基質(zhì)的處理方法相同,只經(jīng)過(guò)甲醇提取、過(guò)濾并用PBST簡(jiǎn)單稀釋

15、即可消除基質(zhì)影響,因此適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。2.4交叉反應(yīng)選擇5種氯霉素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物和常見(jiàn)獸藥分別采用2種形式進(jìn)行抗體結(jié)合反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯霉素琥珀酸鈉的質(zhì)量濃度為1g/L時(shí)顏色淺于對(duì)照,說(shuō)明該抗體與氯霉素琥珀酸鈉有交叉反應(yīng)。這是因?yàn)槊庖咴铣蓵r(shí)是以氯霉素琥珀酸鈉為主要反應(yīng)物,而抗體與氟甲砜霉素、甲砜霉素及其它常用抗菌藥物氨卞西林、磺胺二甲基嘧啶無(wú)交叉反應(yīng),即使其質(zhì)量濃度為1mg/L時(shí)檢測(cè)帶顏色與空白對(duì)照無(wú)差別。因此除氯霉素琥珀酸鈉外,其余藥物均不影響2種方法對(duì)氯霉素的檢測(cè)效果。2.5有效性的驗(yàn)證將30例陰性豬肉樣品添加不同濃度的氯霉素,采用酶聯(lián)免疫方法和2種形式的試紙條分別進(jìn)行檢測(cè),并比較結(jié)果(見(jiàn)表

16、1。試紙條顏色明顯淺于空白對(duì)照判斷為陽(yáng)性(+,無(wú)法判斷記為(±,顏色與空白對(duì)照相同判斷為陰性(-。試驗(yàn)結(jié)果表明,2種試紙條檢測(cè)形式與定量ELISA的檢測(cè)結(jié)果一致,適用于實(shí)際樣品中氯霉素的檢測(cè)。2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)采用加速試驗(yàn)進(jìn)行穩(wěn)定性研究。37保存7d 相當(dāng)于4保存6個(gè)月。研究發(fā)現(xiàn),膠體金標(biāo)記抗體在37保存7d后,2種檢測(cè)形式的檢出限沒(méi)有變化(圖略,說(shuō)明金標(biāo)抗體在保存期內(nèi)穩(wěn)定性很好。滲濾式試紙條于37干燥保存7d后,檢出限仍達(dá)0.8g/L(圖略。側(cè)流式試紙條于37干燥保存1d后檢出限沒(méi)有變化,但第3天后,顏色變淺,且顏色梯度變差,說(shuō)明穩(wěn)定性和有效性不如滲濾式,分析其原因可能是37貯存改變

17、了膜的微觀結(jié)構(gòu),影響了物質(zhì)在膜上的層析,從而影響檢測(cè)效果,但如果在4下保存的試紙條微觀結(jié)構(gòu)不會(huì)改變,側(cè)流式檢測(cè)也應(yīng)該有較好的穩(wěn)定性。2.7滲濾式和側(cè)流式的比較滲濾式方法屬于免疫濃縮(immuno-concen-tration反應(yīng),金標(biāo)抗體與待測(cè)液的混合物集中在反應(yīng)區(qū)與包被原進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)物損失小,因此靈敏度高。該方法的缺陷是基質(zhì)中所有物質(zhì)均在反應(yīng)區(qū)內(nèi),反應(yīng)受基質(zhì)的影響大。而側(cè)流式方法屬于免疫層析反應(yīng),物質(zhì)在膜上通過(guò)毛細(xì)管作用向上層析,到達(dá)包被區(qū)域后與包被原結(jié)合。由于層析作注:氯霉素質(zhì)量濃度從左至右分別為0、1、10、50g/L。圖4側(cè)流式試驗(yàn)結(jié)果Fig.4Result of the Later

18、al flow assay 添加水平/g·L-1ELISA測(cè)定結(jié)果/g·L-1滲濾式試紙條測(cè)定結(jié)果/例側(cè)流式試紙條測(cè)定結(jié)果/例00-:10-:102016.06+:10-:9±:14032.12+:10+:10表1豬肉樣品不同添加水平的ELISA及試紙條測(cè)定結(jié)果的比較Table1Comparation of the detection results of pork Sample by ELISA and the strips免疫膠體金法快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留的研究199中國(guó)食品學(xué)報(bào)2009年第1期用到達(dá)反應(yīng)區(qū)的物質(zhì)減少,使基質(zhì)對(duì)反應(yīng)的影響也相應(yīng)減小,但

19、同時(shí)由于膜的非特異吸附,反應(yīng)物有一定損失,因此靈敏度稍差。側(cè)流式對(duì)環(huán)境濕度很敏感,試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),包被時(shí)若環(huán)境濕度大于40%,很容易使條帶增寬或不均勻,從而影響結(jié)果的判斷。參考文獻(xiàn)1.陳雪昌,劉琴,鐘志,等.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)蝦肉中氯霉素J.浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版,2005,24(1:7376.2.Allen E H.Review of chromatographic methods for chloramphenicol residues in milk,eggs,and tissues from food-producing animalsJ.J.Assoc Off Anal Chem,19

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23、henicolResidues in Animal Derived FoodZhang Yan Wang Wei Liu Junwei Wang Shuo(Tianjin Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Faculty of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin Universityof Science and Technology,Tianjin300457Abrstract Objective:Based on the principle of competitive immunoass

24、ay,flow through and lateral flow colloidal gold-labled test strips were established for the rapid on-site detection of chloramphenicol(CAPresidues.Methods:Col-loidal gold was obtained by reducing the gold chloride with sodium citrate,and labeled to an anti-CAP polyclonal anti-body(PAb.CAP was conjugated to ovalbumin(OVAand coated on a nitrocellulose(NCmembrane as the test zone. The analyte in the samples competed with the immobilized CAP conjugate in the test zone for binding the gold col-loidal-labeled antibody.The more analyte present in the sample,the more effectiv