免疫膠體金法快速檢測動物源性食品中氯霉素殘留的研究

1、免疫膠體金法快速檢測動物源性食品中氯霉素殘留的研究張燕王瑋劉俊偉王碩(天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院天津市食品營養(yǎng)與安全重點實驗室天津300457摘要目的:優(yōu)化建立滲濾式(Flow through 和側(cè)流式(Lateral flow 兩種金標記免疫競爭快速篩選方法。方法:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,標記氯霉素多克隆抗體,以硝酸纖維素膜為載體,包被氯霉素半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物作為檢測帶,經(jīng)過競爭反應后目測結(jié)果。結(jié)果:通過簡單的樣品前處理方法,消除了基質(zhì)影響,可成功用于豬肉、雞肉和鱈魚樣品中痕量氯霉素殘留的快速檢測。檢測標準溶液及組織試樣的提取稀釋液時,靈敏度分別為0.8g/L 和1g/

2、L 。幾種氯霉素的結(jié)構(gòu)類似物及常見獸藥對氯霉素檢測均無干擾,通過酶聯(lián)免疫吸附定量檢測方法驗證了2種快速篩選方法的有效性,加速穩(wěn)定性試驗證明滲濾式金標試紙條在4下6個月內(nèi)可保持檢測結(jié)果的可靠性。結(jié)論:所建立的方法操作簡單,快速,靈敏度高,穩(wěn)定性好,可作為動物源性食品中氯霉素殘留現(xiàn)場大量篩選的有效手段。關(guān)鍵詞氯霉素膠體金滲濾式側(cè)流式文章編號1009-7848(200901-0196-05氯霉素(chloramphenicol ,CAP 是一種高效廣譜抗生素,常用于動物各種傳染性疾病的治療1,但氯霉素對人體有嚴重的毒副作用24。目前美國和歐共體已禁止在食用性動物中使用氯霉素,并規(guī)定在動物源性食品中不

3、得檢出。我國農(nóng)業(yè)部在2002年12月第235號公告動物性食品中獸藥最高殘留限量中規(guī)定氯霉素為禁用藥物,在動物性食品中不得檢出。因此,發(fā)展快速靈敏的檢測技術(shù)已成為氯霉素殘留檢測的研究焦點。1971年Faulk 和Taylor 5將膠體金應用于免疫化學中,使膠體金在生物醫(yī)學、食品安全、環(huán)境保護等諸多領(lǐng)域得到廣泛應用。20世紀80年代末期,人們把膠體金免疫技術(shù)與固相膜結(jié)合,建立了膠體金免疫快速檢測方法。目前常見的檢測形式有:滲濾式(Flow through 和側(cè)流式(Lateral flow 6。本文研究2種膠體金標記試紙條,用于豬肉、雞肉及鱈魚中的氯霉素殘留的快速檢測,可作為現(xiàn)場大量樣品快速篩選的

4、有效工具。1材料與方法1.1材料Linomat 5半自動點樣儀,瑞士Camag ;酶標測定儀,美國Thermo ;CARY 50Bio 紫外-可見分光光度計,美國Varian ;Milli-Q 純水發(fā)生器,美國Millipore ;硝酸纖維素膜,美國Pierce ,catalogno.88018;Hi-flow plus 型纖維素膜及墊片,美國Millipore ,part no.HF090MC100;吸收墊,美國Millipore ,part no.CFSP223000;氯金酸(HAuC 14·4H 2O ,分析純,上?；瘜W試劑有限公司;氯霉素標準品、牛血清白蛋白(BSA 、卵清蛋

5、白(OVA 、辣根過氧化物酶和羊抗兔二抗,美國Sigma 公司。膠體金透射電鏡掃描由天津師范大學電鏡室完成。氯霉素半抗原、抗體、包被抗原(CAP-OVA 、酶標抗原,天津科技大學食品安全研究室自制78。金標抗體儲存液:0.3814g 硼酸鈉,0.5g BSA 和0.5g 疊氮鈉(NaN 3,溶于500mL 二次水;0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS pH 7.4;包被液:pH 9.6碳酸鹽緩沖溶液;封閉液:1%BSA-PBS ;洗滌液:PBST (含0.05%Tween-20的PBS ;顯色底物溶液:TMB/H 2O 2;終止液:1.25mol/L 硫酸;其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。收稿

6、日期:2008-02-27基金項目:國家科技支撐計劃資助項目(No.2006BAD05A06作者簡介:張燕,女,1970年出生,副教授通訊作者:王碩Vol.9No.1Feb .2009Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology中國食品學報第9卷第1期2009年2月第9卷第1期1.2試驗方法1.2.1膠體金及抗體標記物的制備采用檸檬酸三鈉還原法9制備膠體金。膠體金溶液自然冷卻后,用0.1mol/L K2CO3調(diào)節(jié)其pH至9.0,在磁力攪拌下,向20mL膠體金溶液中逐滴加入336g抗體,10min后逐滴加入10%的BSA,

7、使溶液中BSA 的終含量為1%,攪拌30min后置于4過夜。1500r/min離心10min,取上清液于4、10000 r/min離心30min,棄上清液。用儲存液溶解膠體金至1mL,重復上一步離心步驟,棄上清,膠體金用儲存液重懸至原體積的1/10,4保存。1.2.2試紙條的制備以硝酸纖維素膜為固相載體,每條帶包被CAP-OVA1g作為檢測帶(Test zone,T帶;每條帶包被羊抗兔二抗0.5g作為質(zhì)控帶(Control zone,C帶,T帶與C帶間隔3mm。先將硝酸纖維素膜裁成一定大小(滲濾式0.7cm×1.5cm,側(cè)流式0.5cm×2cm,再置于37恒溫箱中固定15m

8、in,經(jīng)封閉液封閉30min,PBST沖洗3次,37干燥后4保存。1.2.3試紙條的組裝6滲濾式形式(見圖1:用水將濾紙潤濕后緊貼在惰性塑料底板上,再把試紙條正面朝上緊貼在濕潤的濾紙上,加樣時另取一張干凈的濾紙在邊緣吸水以促進樣液的滲濾。側(cè)流式形式(見圖2:將吸水板裁剪成同側(cè)流式膜的寬度,粘貼在膜的上端(與膜有部分重疊,壓緊,裝入帶有干燥劑的密封筒中,于4保存。圖1金標記滲濾式分析裝置示意圖Fig.1Schematic diagram of the analytical device for Flow through immunogold assay圖2金標記Lateral flow分析裝置示

9、意圖Fig.2Schematic diagram of the analytical device for Lateral flow immunogold assay1.2.4競爭反應滲濾式形式:將金標記抗體(經(jīng)連接儲備緩沖液12稀釋與含CAP的待測液按13的體積比例(30L+90L混合均勻,取100L混合液加入包被有半抗原的區(qū)域。待液體完全滲透過膜上的反應區(qū)后,在C帶顯色的前提下,目視T帶的顏色,與空白對照,顏色越淺,代表CAP 含量越高。倒流式形式:將金標記抗體(經(jīng)連接儲備緩沖液12稀釋與含CAP的待測液按14的體積比例(20L+80L混合均勻,同時設(shè)空白對照(不含CAP,將組裝好的試紙條

10、分別浸入相應的混合液中,反應5min后與陰性對照,結(jié)果判定同上。1.2.5最低檢出限的確定將氯霉素標準品用含5%甲醇的PBST溶液稀釋成系列梯度:0.1、0.5、0.8、1、10、50g/L,取上述梯度稀釋液與膠體金標記抗體按比例混合后再與包被原進行競爭反應,以能與空白對照有明顯色差的最小濃度為檢出限。1.2.6樣品(豬肉、雞肉、鱈魚預處理稱取試樣2g置于樣品瓶中,加入4mL甲醇,旋渦振蕩2免疫膠體金法快速檢測動物源性食品中氯霉素殘留的研究197中國食品學報2009年第1期min,過濾。1.2.7樣品基質(zhì)影響的消除將陰性樣品(經(jīng)液相驗證不含CAP處理液用PBST稀釋5、10、15、20倍,同時

11、將甲醇用同樣的方法稀釋作為空白對照,進行競爭反應?；|(zhì)稀釋液與相應空白對照的檢測帶顏色相同時判斷基質(zhì)影響消除。1.2.8交叉反應選擇氯霉素琥珀酸鈉、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氨卞西林和磺胺二甲基嘧啶5種藥物,分別配成系列濃度,用2種檢測方法分別進行競爭反應。1.2.9有效性的驗證選擇豬肉樣品(經(jīng)液相檢測不含氯霉素做氯霉素添加檢測試驗,樣品處理方法見本文1.2.6節(jié),同時采用酶聯(lián)免疫定量分析法和膠體金試紙條方法進行檢測,判斷檢測結(jié)果的一致性。定量方法:在96孔酶標板上用包被液包被抗體(1g/孔,室溫孵育過夜。用PBST洗板3次,封閉液封閉1h。棄封閉液后,再用PBST洗板3次。加入不同濃度的CAP標

12、準液或樣品稀釋液100L/孔和酶標抗原100L/孔,室溫孵育1h。洗板后加底物液150L/孔,室溫顯色30min,加終止液(1.25mol/L濃硫酸50L/孔,終止反應,酶標儀讀數(shù),測450nm處吸光值(參考波長為650nm。1.2.10穩(wěn)定性試驗將試紙條和金標記抗體分裝后置于37做穩(wěn)定性試驗。在第1、3、5、7天時分別取出,進行競爭反應,觀察顏色的變化。2結(jié)果與討論2.1膠體金的制備檸檬酸三鈉還原法制備膠體金時,應迅速地一次性加入還原劑,不要逐滴或間斷加入,否則易使制得的金顆粒大小不均,形成聚合物,從而使膠體溶液不穩(wěn)定。本試驗中制備的膠體金狀態(tài)為澄清的紅色溶液,表面無漂浮物,說明無聚合物產(chǎn)生

13、。對自然冷卻后的膠體金溶液利用紫外-可見光分光光度計在可見光范圍(400600nm內(nèi)進行掃描,得到單一的吸收峰,最大吸收峰波長為522.0 nm。經(jīng)透射電鏡掃描,膠體金顆粒均勻,平均粒徑為20nm。2.2檢出限的確定通過對半抗原偶聯(lián)物的包被量、金標記抗體的稀釋比例、金標記抗體與待測液混合比例等條件的優(yōu)化,建立了滲濾式和側(cè)流式2種檢測形式。用這2種檢測形式對氯霉素標準溶液進行檢測,結(jié)果表明,當CAP質(zhì)量濃度低于0.8g/L時,滲濾式檢測帶的顏色與空白對照無法通過目測區(qū)別;大于或等于0.8g/L時可分辨出顏色差別,因此確定滲濾式試紙條對氯霉素的檢出限為0.8g/ L。用同樣的方法確定側(cè)流式試紙條的

14、檢出限為1g/L。隨著氯霉素的濃度升高,兩種方法檢測帶的顏色均逐漸變淺,說明在一定范圍內(nèi)該方法可有效檢測氯霉素殘留量。結(jié)果見圖3、圖4。注:氯霉素質(zhì)量濃度從左至右分別為:0、0.8、10、50g/L。圖3滲濾式試驗結(jié)果Fig.3Result of the Flow through assay 198第9卷第1期2.3樣品基質(zhì)影響的消除將樣品提取液用PBST稀釋不同倍數(shù)后做競爭試驗,當檢測帶與空白對照顏色相同時視為基質(zhì)影響消除。經(jīng)過5次重復試驗,確定了豬肉、雞肉、鱈魚3種基質(zhì)的稀釋倍數(shù)分別為10、10、5倍。本試驗樣品處理方法簡便,3種基質(zhì)的處理方法相同,只經(jīng)過甲醇提取、過濾并用PBST簡單稀釋

15、即可消除基質(zhì)影響,因此適于現(xiàn)場快速檢測。2.4交叉反應選擇5種氯霉素結(jié)構(gòu)類似物和常見獸藥分別采用2種形式進行抗體結(jié)合反應,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯霉素琥珀酸鈉的質(zhì)量濃度為1g/L時顏色淺于對照,說明該抗體與氯霉素琥珀酸鈉有交叉反應。這是因為免疫原合成時是以氯霉素琥珀酸鈉為主要反應物,而抗體與氟甲砜霉素、甲砜霉素及其它常用抗菌藥物氨卞西林、磺胺二甲基嘧啶無交叉反應,即使其質(zhì)量濃度為1mg/L時檢測帶顏色與空白對照無差別。因此除氯霉素琥珀酸鈉外,其余藥物均不影響2種方法對氯霉素的檢測效果。2.5有效性的驗證將30例陰性豬肉樣品添加不同濃度的氯霉素,采用酶聯(lián)免疫方法和2種形式的試紙條分別進行檢測,并比較結(jié)果(見表

16、1。試紙條顏色明顯淺于空白對照判斷為陽性(+,無法判斷記為(±,顏色與空白對照相同判斷為陰性(-。試驗結(jié)果表明,2種試紙條檢測形式與定量ELISA的檢測結(jié)果一致,適用于實際樣品中氯霉素的檢測。2.6穩(wěn)定性試驗采用加速試驗進行穩(wěn)定性研究。37保存7d 相當于4保存6個月。研究發(fā)現(xiàn),膠體金標記抗體在37保存7d后,2種檢測形式的檢出限沒有變化(圖略,說明金標抗體在保存期內(nèi)穩(wěn)定性很好。滲濾式試紙條于37干燥保存7d后,檢出限仍達0.8g/L(圖略。側(cè)流式試紙條于37干燥保存1d后檢出限沒有變化,但第3天后,顏色變淺,且顏色梯度變差,說明穩(wěn)定性和有效性不如滲濾式,分析其原因可能是37貯存改變

17、了膜的微觀結(jié)構(gòu),影響了物質(zhì)在膜上的層析,從而影響檢測效果,但如果在4下保存的試紙條微觀結(jié)構(gòu)不會改變,側(cè)流式檢測也應該有較好的穩(wěn)定性。2.7滲濾式和側(cè)流式的比較滲濾式方法屬于免疫濃縮(immuno-concen-tration反應,金標抗體與待測液的混合物集中在反應區(qū)與包被原進行反應,反應物損失小,因此靈敏度高。該方法的缺陷是基質(zhì)中所有物質(zhì)均在反應區(qū)內(nèi),反應受基質(zhì)的影響大。而側(cè)流式方法屬于免疫層析反應,物質(zhì)在膜上通過毛細管作用向上層析,到達包被區(qū)域后與包被原結(jié)合。由于層析作注:氯霉素質(zhì)量濃度從左至右分別為0、1、10、50g/L。圖4側(cè)流式試驗結(jié)果Fig.4Result of the Later

18、al flow assay 添加水平/g·L-1ELISA測定結(jié)果/g·L-1滲濾式試紙條測定結(jié)果/例側(cè)流式試紙條測定結(jié)果/例00-:10-:102016.06+:10-:9±:14032.12+:10+:10表1豬肉樣品不同添加水平的ELISA及試紙條測定結(jié)果的比較Table1Comparation of the detection results of pork Sample by ELISA and the strips免疫膠體金法快速檢測動物源性食品中氯霉素殘留的研究199中國食品學報2009年第1期用到達反應區(qū)的物質(zhì)減少,使基質(zhì)對反應的影響也相應減小,但

19、同時由于膜的非特異吸附,反應物有一定損失,因此靈敏度稍差。側(cè)流式對環(huán)境濕度很敏感,試驗中發(fā)現(xiàn),包被時若環(huán)境濕度大于40%,很容易使條帶增寬或不均勻,從而影響結(jié)果的判斷。參考文獻1.陳雪昌,劉琴,鐘志,等.酶聯(lián)免疫法檢測蝦肉中氯霉素J.浙江海洋學院學報(自然科學版,2005,24(1:7376.2.Allen E H.Review of chromatographic methods for chloramphenicol residues in milk,eggs,and tissues from food-producing animalsJ.J.Assoc Off Anal Chem,19

20、85,68:990999.3.關(guān)嶸.應用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測動物源性食品中氯霉素殘留的研究J.檢驗檢疫科學,2002,12(4:510.4.楊成對,宋莉暉,毛麗哈,等.對蝦中氯霉素殘留的分析方法研究J.分析化學,2004,32(7:905907.5.Faulk WP,Taylor GM.An immunocolloid method for the electron microscopeJ.Immunochemistry,1971,8:10811083.6.李永勤.以膜為固相載體的免疫膠體金快速試驗J.微生物學免疫學進展,2003,31(1:7478.7.Wang S.,Allan R.D.,Sk

21、erritt,et al.Development of a class-specific competitive ELISA for the benzoylphenylureainsecticidesJ.Journal of Agriculture and Food Chemistry,1998,46(8,33303338.8.Wang S.,Zhang J.Yang Z.Y.,et al.Development of two enzyme-linked immunosorbent assays for detection of endo-sulfan residues in agricult

22、ural productsJ.Journal of Agriculture and Food Chemistry,2005,53(19:73777384.9.Frens G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensionsJ.Nature Phys.Sci.,1973,241(105:2022.Study on the Colloidal Gold-based Immunoassays for the Rapid Detection of Chloramp

23、henicolResidues in Animal Derived FoodZhang Yan Wang Wei Liu Junwei Wang Shuo(Tianjin Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Faculty of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin Universityof Science and Technology,Tianjin300457Abrstract Objective:Based on the principle of competitive immunoass

24、ay,flow through and lateral flow colloidal gold-labled test strips were established for the rapid on-site detection of chloramphenicol(CAPresidues.Methods:Col-loidal gold was obtained by reducing the gold chloride with sodium citrate,and labeled to an anti-CAP polyclonal anti-body(PAb.CAP was conjugated to ovalbumin(OVAand coated on a nitrocellulose(NCmembrane as the test zone. The analyte in the samples competed with the immobilized CAP conjugate in the test zone for binding the gold col-loidal-labeled antibody.The more analyte present in the sample,the more effectiv