粒體DNa片段誘導小鼠胚胎成纖維細胞惡性轉(zhuǎn)化

1、    粒體DNa片段誘導小鼠胚胎成纖維細胞惡性轉(zhuǎn)化            摘 要 目的：探討線粒體DNA(mtDNA)片段的惡性轉(zhuǎn)化效應和轉(zhuǎn)化機制。方法：采用基因轉(zhuǎn)入技術(shù)，觀察經(jīng)mtDNA片段轉(zhuǎn)染后小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)在裸小鼠體內(nèi)的成瘤能力，并對形成的腫瘤進行病理觀察；同時應用熒光原位雜交(FISH)方法，觀察mtDNA片段在NIH3T3細胞核內(nèi)的整合情況。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后1周,18%20%的NIH3T3細胞核中發(fā)現(xiàn)有目的基

2、因探針的陽性雜交信號；轉(zhuǎn)染后2周的培養(yǎng)細胞在裸小鼠皮下形成腫瘤的能力為100%(8/8)；且形成腫瘤的病理表現(xiàn)與纖維肉瘤的特征相一致。結(jié)論：mtDNA片段在核基因組中的自發(fā)整合是促發(fā)細胞癌變的又一因素。    關(guān)鍵詞：DNA,線粒體 成纖維細胞 小鼠,裸 動物實驗替代試驗    目前，關(guān)于腫瘤病毒或活化癌基因能誘導良性細胞惡性轉(zhuǎn)化的研究已非常普遍。但作為哺乳動物細胞唯一核外基因組的線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)，是否也具有類似于腫瘤病毒那樣的活性尚缺乏有力的實驗證據(jù)1，2。前期研究

3、發(fā)現(xiàn)，癌細胞核基因組中存在mtDNA的同源序列。這些同源序列的來源及其在細胞癌變中的作用也僅僅是理論上的推測。我們通過mtDNA片段向小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)進行基因轉(zhuǎn)入的方法，探討了mtDNA片段的惡性轉(zhuǎn)化效應及轉(zhuǎn)化機制。    材料與方法    1.主要試劑：PCR試劑盒,PCR產(chǎn)物純化試劑盒,PCR地高辛(DIG)探針合成試劑盒，抗DIG熒光抗體均為德國寶靈曼公司產(chǎn)品。    2.實驗動物： 選大小相近的BALB/C裸小鼠16只,體重13 g±5 g

4、，用于轉(zhuǎn)化細胞體內(nèi)接種實驗。    3.受體細胞及細胞培養(yǎng)：選用NIH3T3(美國，NIH)為受體細胞。將3×105細胞接種于100 ml細胞培養(yǎng)方瓶中,加入含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 5% CO2孵箱中無菌培養(yǎng)，每3天傳代1次。    4.目的mtDNA基因片段的PCR擴增與純化： 引物1：5-ATCTTAATGGCACATGCAGC-3,引物2：3-TCTAATGTGTACGTTCGTTCGTAG-5, 擴增包含Co、tRNALys、ATPase 6共3個完整基因在內(nèi)的1 62

5、6 bp mtDNA片段。用此片段作為轉(zhuǎn)染目的基因片段。以人肺腺癌SPC-A-1細胞(取自中科院上海細胞所)mtDNA為模板，擴增的mtDNA基因片段，代表癌細胞來源的mtDNA片段；以1名無腫瘤及也無其他遺傳病家族史的45歲健康男性外周血白細胞mtDNA為模板，擴增的mtDNA片段，代表正常細胞來源的mtDNA片段。mtDNA模板的制備及PCR擴增方法參見文獻3，4。 PCR產(chǎn)物的純化參照試劑盒說明書進行。    5.實驗分組：組：NIH3T3細胞不經(jīng)任何因素處理空白對照；組: NIH3T3細胞不加mtDNA片段轉(zhuǎn)染假轉(zhuǎn)染對照； 組:NIH3T3細胞加

6、癌細胞來源的mtDNA片段轉(zhuǎn)染； 組: NIH3T3細胞加白細胞來源的mtDNA片段轉(zhuǎn)染。    6.基因轉(zhuǎn)染:將0.8 ml細胞懸液(4×106/ml)轉(zhuǎn)移至無菌轉(zhuǎn)染杯中，加入10 g mtDNA片段(30 l TE液溶解，組只加30 l空白TE液),混勻，室溫靜置10 min；將轉(zhuǎn)染杯置于基因脈沖儀(Bio-Rad)的放電槽中，800 V電擊0.4 ms，室溫靜置10 min，分裝重新培養(yǎng)，倒置顯微鏡下對比觀察各組細胞的增殖活力和飽和密度變化。    7.染色體制備及G顯帶：取組和轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1周的、組

7、細胞，參照吳秉銓介紹的方法5進行。結(jié)果判斷：以20對染色體核型為二倍體，多于或少于20對者為異倍體。    8.熒光原位雜交(FISH)：采用步驟4的白細胞mtDNA為模板，引物1和引物2配對，DIG標記PCR擴增合成1 626 bp mtDNA探針并純化；參照路建平介紹的方法6進行FISH分析。    9.轉(zhuǎn)化細胞裸小鼠體內(nèi)接種及病理觀察：組和轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2周的、 組細胞各取4×106個,用0.8 ml含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮,等分后接種于裸小鼠右腋部皮下,每組2只。作好標記，飼養(yǎng)2

8、3個月，觀察裸小鼠的存活及腫塊生長情況。對形成腫瘤進行大體形態(tài)、光鏡及電鏡觀察。首次實驗結(jié)束后，進行包括轉(zhuǎn)染、接種在內(nèi)的重復實驗。    10.統(tǒng)計學方法:采用卡方檢驗。    結(jié)果    1.mtDNA目的基因片段及DIG標記探針電泳分析：兩種細胞來源的mtDNA模板經(jīng)擴增后,獲得了1 626 bp的目的基因片段和DIG標記的探針,純化后引物二聚體及多余的單核苷酸消失(1)。    2.轉(zhuǎn)染細胞生長特性變化：組和組細胞呈單層生長；而組

9、和組細胞在轉(zhuǎn)染24 h后部分死亡，48 h后殘余細胞恢復增殖活力，達到飽和密度時呈重疊生長。    1.SPC-A-1細胞mtDNA為模板擴增的目的基因片段；    2.正常人白細胞mtDNA為模板擴增的目的基因片段；    3.正常人白細胞mtDNA為模板擴增的DIG標記探針；    4. DNA/Hind III Marker。    1 1 626 bp mtDNA目的基因片段及DIG標記探

10、針電泳譜    3.轉(zhuǎn)染細胞染色體倍性變化：組和組細胞染色體核型中60%為二倍體，40%為異倍體；而組和組細胞染色體核型中異倍體達90%以上。    4.FISH分析：組和組細胞中期染色體或間期核中均無人mtDNA探針的陽性雜交信號，而組和組部分細胞中期染色體或間期核中出現(xiàn)了陽性雜交信號(25)；組陽性率為20%，組陽性率為18%，兩組間差異無顯著性。    5.轉(zhuǎn)染細胞在裸小鼠體內(nèi)的成瘤能力：組和組細胞在裸小鼠皮下形成腫瘤陽性率為0(0/8)；而組和組細胞在裸小鼠皮下形成腫

11、瘤陽性率為100%(8/8)。    6.形成腫瘤的病理變化：組和組細胞的形成腫瘤。大體形態(tài)上,表面凹凸不平，呈分葉狀，局部有壞死現(xiàn)象，解剖觀察可見皮下的分葉結(jié)節(jié)樣腫塊(6,7)，包膜不完整，與周圍組織有粘連，腫塊的切面呈灰白色，質(zhì)地細膩，似魚肉樣，各臟器未見轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)灶。光鏡下見梭形細胞相互交織，排列紊亂，瘤細胞豐富，大小不一，極性消失，具有顯著的異型性，核分裂象多，膠原纖維和血管少見，瘤細胞之間可見少量脂肪細胞。此外，瘤細胞對鄰近肌組織有明顯的侵襲現(xiàn)象(8,9)。電鏡下見瘤細胞核大，畸形，核膜凹凸不平，核染色質(zhì)分布不均，核仁大，可見較多的雙核仁，細胞粗

12、面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，并有囊狀擴張，線粒體較豐富，但發(fā)育不良，少量細胞胞質(zhì)中可見肌微絲，細胞間隙較明顯，其中可見極少量膠原纖維(10，11)。    2，3 、組細胞中期染色體或間期核中無人mt DNA探針的陽性雜交信號 FISH×1 200 4，5 、組部分細胞中間染色體或間期核中出現(xiàn)了陽性雜交信號(箭頭所示) FISH×1 200 6 組mt DNA-3T3細胞裸小鼠皮下形成腫瘤 7 組mt DNA-3T3細胞裸小鼠皮下形成腫瘤 8 組細胞核分裂象多，異型性顯著，瘤細胞間可見較多脂肪細胞，膠原纖維少 HE×400 9 組細胞核分

13、裂象多，異型性顯著，瘤細胞侵襲鄰近肌組織 HE×400    10 組：瘤細胞核大，畸形，雙核仁，核膜凹凸不平 ×4 000    11 組瘤細胞核/質(zhì)比值明顯增大，畸形核，核膜凹凸不平 ×4 000    討論    1.mtDNA片段的惡性轉(zhuǎn)化效應：線粒體是哺乳動物細胞中唯一含有自身遺傳物質(zhì)的細胞器,同時，它又是各種損傷因子作用的敏感部位。因此，細胞中線粒體損傷導致其中的遺傳物質(zhì)即mtDNA釋放事件可能

14、時有發(fā)生。 那么，這些游離于細胞質(zhì)中的mtDNA片段是否也具有類似于腫瘤病毒或活化癌基因那樣的致癌活性呢？國內(nèi)外已對此問題引起了重視7。我們在兩次重復性研究中均發(fā)現(xiàn)，經(jīng)mtDNA片段轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞(簡稱mtDNA-3T3)，在體外培養(yǎng)2周后接種于裸小鼠皮下，歷時23個月， 都長出了瘤結(jié)節(jié)，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染或假轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞，在裸小鼠皮下均未形成瘤結(jié)節(jié)。 表明mtDNA片段能使NIH3T3細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，并能使轉(zhuǎn)化細胞獲得體內(nèi)成瘤能力。病理觀察發(fā)現(xiàn),mtDNA-3T3細胞所形成的瘤結(jié)節(jié)，與纖維肉瘤的病理特征一致8。表明mtDNA片段能使NIH3T3細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。我們通過設(shè)立癌細胞來源

15、和正常細胞來源的mtDNA片段進行轉(zhuǎn)染的對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的轉(zhuǎn)化活力差異無顯著性。由此推測，生理狀態(tài)下任何細胞的mtDNA游離片段都可能具有潛在的轉(zhuǎn)化活性。    2.mtDNA片段誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化的機理：眾多研究表明，外源性核酸誘發(fā)宿主細胞惡性轉(zhuǎn)化,是通過遺傳信息在宿主細胞核DNA中整合來實現(xiàn)的9。整合結(jié)果使宿主細胞形成了轉(zhuǎn)化基因，從而產(chǎn)生一種或數(shù)種轉(zhuǎn)化蛋白。這些轉(zhuǎn)化蛋白在促發(fā)細胞轉(zhuǎn)化和維持細胞的轉(zhuǎn)化狀態(tài)方面發(fā)揮了重要作用。通常，在腫瘤病毒感染宿主細胞3648 h就可以使宿主細胞發(fā)生明顯的轉(zhuǎn)化。我們發(fā)現(xiàn)，在mtDNA片段轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞后第7

16、d時，mtDNA-3T3細胞染色體核型已發(fā)生了顯著變化，表現(xiàn)為異倍體細胞明顯增加。與此同時，在mtDNA-3T3細胞中期染色體或間期核中， mtDNA探針雜交出現(xiàn)陽性信號者占18%20%，對照組全為陰性。結(jié)果表明，經(jīng)電脈沖方法導入NIH3T3細胞胞質(zhì)中的 mtDNA片段，可自發(fā)地向細胞核內(nèi)移動并整合于核基因組中，這種整合與mtDNA-3T3細胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。    成纖維細胞來自中胚層，具有多向分化的潛能。當它遇到合適的刺激，便可分化成脂肪細胞、結(jié)締組織細胞、肌細胞等10。我們發(fā)現(xiàn)，mtDNA-3T3細胞形成的腫瘤中可見少量脂肪細胞和肌樣細胞， 表

17、明mtDNA片段不僅是一種惡性轉(zhuǎn)化的促發(fā)因子，也可以引起細胞多向分化。 同時，也證明mtDNA片段在受體細胞核中的整合是隨機的。這與DNA病毒在宿主細胞核DNA中整合的方式相近似。由此可見,mtDNA片段在核基因組中的隨機自發(fā)整合是促發(fā)細胞癌變的又一因素。 關(guān)于mtDNA片段與核基因組整合誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化的下游機制尚有待深入探討。    基金項目：國家自然科學基金資助項目(39500173)    胡義德(Email: floride)    作者單位：胡義德 第三軍醫(yī)大學新

18、橋醫(yī)院全軍呼吸內(nèi)科研究所，重慶 400037    錢桂生 第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院全軍呼吸內(nèi)科研究所，重慶 400037    毛寶齡 第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院全軍呼吸內(nèi)科研究所，重慶 400037    肖桃元 第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院基礎(chǔ)部，重慶 400037    李 懿 第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院基礎(chǔ)部，重慶 400037    曹世龍 上海醫(yī)科大學    參考文獻

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