熒光定量PCR聯(lián)合ELISA檢測丙型肝炎病毒的臨床應用研究

1、熒光定量PCR聯(lián)合ELISA檢測丙型肝炎病毒的臨床應用研究    我國一般人群抗-HCV陽性率為3.21，急性丙型肝炎絕大多數(shù)都將形成慢性丙型肝炎，是形成肝硬化和肝癌的重要原因2。目前，醫(yī)院和血站大多采用ELISA法檢測血清中抗-HCV來診斷可疑感染者和篩選獻血員。     作者：高英英，馬雷，孫玉鴻    作者單位：佳木斯大學臨床醫(yī)學院檢驗系，黑龍江 佳木斯 154003；佳木斯大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，黑龍江 佳木斯 154003   【摘要】  目的：

2、探討熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（FQ-PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒的臨床意義。方法：用FQ-PCR聯(lián)合ELISA方法檢測117例臨床已確診為丙型肝炎患者的血清，同時檢測它們的丙氨酸氨基轉移酶（AAT）。結果：抗-HCV陽性率隨著HCV-RNA含量的升高而增高，其陽性率與HCV-RNA含量呈正相關。87例HCV-RNA陽性標本中，有50例ALT異常，其異常率隨著HCV-RNA含量的升高而增高，ALT異常率與HCV-RNA含量呈正相關， ALT水平和HCV-RNA含量之間呈正相關。FQ-PCR檢測敏感性為74.4%(87/117)，漏檢率為25.6%（30/117）

3、。ELISA法檢測敏感性為76.9%（90/117），漏檢率為23.1%（27/117）。兩種方法聯(lián)合檢測敏感性為92.3%(108/117)，漏檢率為7.7%（9/117）。結論：兩種方法聯(lián)合檢測，互相補充，大大提高了丙型肝炎病毒的檢出率，為臨床早期，準確診斷丙型病毒肝炎、監(jiān)測病情、觀察療效提供了有力的依據(jù)，為獻血人員篩選和血制品安全提供了有力保障。 【關鍵詞】  丙型肝炎病毒核酸；丙型肝炎病毒抗體；熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應；酶聯(lián)免疫吸附試驗；丙氨酸氨基轉移酶 Detection of hepatitis C virus by FQ-PCR and ELISA: Clinical

4、 application GAO Yingying，MA Lei，SUN Yuhong     1.The Clinical Medical College of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China;2.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China     Abstract:Objective:To discuss the clinical significance of detectio

5、n of hepatitis C virus by FQ-PCR and ELISA.Methods:We detected of 117 sera of clinical patients who had been diagnosed as hepatitis C,and at the same time tested their alanine aminotransferase(AAT).Results: Anti-HCV's positive rate rose with HCV-RNA content increase. By using correlation analysi

6、s,anti-HCV positive rate and  HCV-RNA content showed positive correlation.There were 50 AAT abnormal ones in 87 HCV-RNA positive samples.AAT abnormal rate rose with HCV-RNA content increase,showing positive correlation by using correlation analysis, and  there was a positive correlation be

7、tween the AAT level and HCV-RNA content.FQ-PCR detection sensitivity was 74.4%(87/117),and omission factor was 25.6%（30/117）.ELISA detection sensitivity was 76.9%（90/117）,and omission factor was 23.1%（27/117）.Combined detection sensitivity of two kinds of methods was 92.3%(108/117),and omission fact

8、or was 7.7%（9/117）.Combined detection sensitivity was higher than that of separate.Conclusion:The combined detection  is complementary,and greatly improves the hepatitis C virus detection rate,providing a powerful basis for clinical early and accurate diagnosis of hepatitis C virus,condition mo

9、nitoring,and clinical observation, and providing a strong support for screening blood donors and safety of blood products.     Key words:HCV-RNA；anti-HCV；FQ-PCR；ELISA；AAT 我國一般人群抗-HCV陽性率為3.21，急性丙型肝炎絕大多數(shù)都將形成慢性丙型肝炎，是形成肝硬化和肝癌的重要原因2。目前，醫(yī)院和血站大多采用ELISA法檢測血清中抗-HCV來診斷可疑感染者和篩選獻血員。但ELISA法檢測血清抗-H

10、CV敏感性不高，存在30左右的漏檢率3,4，耽誤了一部分患者疾病的治療和引起輸血后HCV感染的流行。因此，我們用FQ-PCR聯(lián)合ELISA方法檢測117例臨床已確診為丙型肝炎患者的血清，并同時檢測血清ALT。探索能夠提高丙型肝炎病毒檢出率的方法，為臨床診斷丙型病毒肝炎，判斷病情和療效提供參考依據(jù)。     1  對象和方法     1.1  對象     選取佳木斯大學附屬第一醫(yī)院200601200708門診和住院患者117例，男67例，女50例，年齡1473歲，平均45.0歲。全部病

11、例均為已確診慢性丙型肝炎患者，排除其它型肝炎引起肝損傷的患者。診斷嚴格按照2000年西安中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲分會、肝病學會聯(lián)合修訂的病毒性肝炎防治診斷標準。根據(jù)HCV-RNA含量(拷貝/mL)將資料分為<1×102、1024、1045、1056和>1065個組。       1.2  方法     1.2.1  血清HCV-RNA定量檢測     HCV-RNA的檢測采用FQ-PCR，試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供，核酸擴增儀為美國ABI公

12、司的PE7700型全自動實時熒光定量PCR儀，參考值<1×102拷貝/mL。     1.2.2  抗-HCV檢測     抗-HCV檢測采用ELISA法，嚴格按試劑盒說明書操作，試劑盒由沈陽惠民生物工程有限公司提供。     1.2.3  ALT檢測     血清ALT檢測采用酶動力學法，正常參考值：540U/L(37)，試劑采用日本和光試劑，檢測儀器為日本Olympus AU1000全自動生化分析儀。    

13、; 1.2.4  統(tǒng)計學處理     采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用2檢驗，計量資料以(x±s)表示，組間比較用t檢驗，對HCV-RNA含量的對數(shù)值與ALT含量進行線性相關關系分析和相關性顯著性檢驗，P<0.05為差異有顯著性。     2  結果     2.1  HCV-RNA含量與血清抗-HCV表達     見表1。117例標本經(jīng)FQ-PCR定量檢測，有87例HCV-RNA含量高于1×102拷貝/mL，其

14、中抗-HCV陽性75例，陽性率為86.2%（75/87），而低于1×102拷貝/mL血清標本中，抗-HCV陽性率為50.0%(15/30) ，經(jīng)相關性分析，兩者有明顯相關性(2=16.474，P<0.05)?？?HCV陽性率隨著HCV-RNA含量的升高而增高，經(jīng)相關性分析，其陽性率與HCV-RNA含量呈正相關(r=0.881，P<0.05)。表1  117例標本HCV-RNA含量及抗-HCV檢測結果（略） 2.2  HCV-RNA含量與血清ALT含量關系     見表2。從表2中可看出，87例HCV-RNA含量高于1

15、15;102拷貝/m血清標本中，有50例ALT異常，其異常率隨著HCV-RNA含量的升高而增高，經(jīng)相關性分析，ALT異常率與HCV-RNA含量呈正相關(r=0.921，P<0.05)，而ALT水平和HCV-RNA含量之間亦呈正相關(r=0.894，P<0.05)。表2  117例標本HCV-RNA與血清ALT含量關系（略） 2.3  FQ-PCR聯(lián)合ELISA檢測結果     見表3。FQ-PCR檢測敏感性為74.4%(87/117)，漏檢率為25.6%（30/117）。ELISA法檢測敏感性為76.9%（90/117），漏檢率為2

16、3.1%（27/117），兩種方法檢測血清標本敏感性差異無顯著性（2=0.208，P>0.05)。兩種方法聯(lián)合檢測敏感性為92.3%(108/117)，漏檢率為7.7%（9/117）。聯(lián)合檢測敏感性明顯高于單獨檢測 (2=10.636，P<0.05)。表3  各種實驗方法檢測丙肝病毒敏感性比較（略） 3  討論     HCV-RNA檢測是診斷HCV感染的直接可靠的指標，F(xiàn)Q-PCR方法具有敏感性高、特異性強、自動化程度高和操作簡捷等優(yōu)點?？?HCV試劑采用間接酶聯(lián)免疫法，國內(nèi)多采用第三代抗-HCV ELISA試劑，它包被的抗原為H

17、CV抗原、NS3、NS4和NS5抗原，特異性達到99.0%。本研究中HCV-RNA陽性率為74.4%，漏檢率為25.6%。有15例標本HCV-RNA陰性，而抗-HCV陽性。這可能與抗-HCV抗體為IgG類抗體，特異性差，維持時間長、患者接受抗病毒治療后，HCV復制受限、血液中HCV-RNA含量呈階段性變化、病毒株發(fā)生變異等因素有關5,6。抗-HCV陽性率為76.9%，漏檢率為23.1%。有18例標本抗-HCV陰性，而HCV-RNA陽性。漏檢率高的原因可能是由于部分患者處于感染的早期階段，機體未產(chǎn)生免疫應答或弱表達，而未產(chǎn)生抗體、或者產(chǎn)生的抗體過少，而檢測不到、還可能是病毒株發(fā)生了變異等原因。兩

18、種方法聯(lián)合檢測陽性率為92.3%，漏檢率為7.7%，二者互相補充，大大提高了丙型肝炎病毒的檢出率。本實驗研究結果顯示，抗-HCV指標陽性率隨HCV-RNA含量的增高而增高，ALT異常率及平均含量隨HCV-RNA含量的增高而增高。對患者血清HCV-RNA含量的對數(shù)值與ALT含量進行相關性分析和相關性顯著性檢驗，表明HCV-RNA含量與ALT水平呈正相關。ALT水平升高反映肝細胞破壞程度加劇，ALT下降表示抗病毒的治療取得療效，提示HCV-RNA含量與肝功能損傷呈正相關。     綜上所述，F(xiàn)Q-PCR和ELISA聯(lián)合檢測為臨床早期，準確診斷丙型病毒肝炎、監(jiān)測病情、觀察療效提供了有力的依據(jù)，為獻血人員篩選和血制品安全提供了有力保障。 【參考文獻】   1中華醫(yī)學會肝病學分會、傳染病與寄生蟲病學分會.丙型肝炎防治指南J.中華肝臟雜志,2004,12:194198    2Sarraz