聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)

1、關(guān)鍵詞：核酸標(biāo)記 通過核酸標(biāo)記技術(shù)可將細(xì)胞因子cDNA作為基因探釗檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子基因組DNA或mRNA。主要有以下幾種方法：1.應(yīng)用同位素（或非同位素）標(biāo)記的cDNA探針，檢測經(jīng)Northern blot后細(xì)胞因子mRNA水平或采用打點(diǎn)雜交法。2.應(yīng)用標(biāo)記cDNA探釗與細(xì)胞或組織切片進(jìn)行原位雜交，然后進(jìn)行放射自顯影。3.細(xì)胞因子mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性細(xì)胞因子引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增細(xì)胞因子cDNA,Southern blot后用標(biāo)記探針檢測特異細(xì)胞因子DNA水平。核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)的研究進(jìn)展(作者  傅占江  來源 &#

2、160;摘自：國外醫(yī)學(xué)臨床生化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊)    聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）自1985年問世以來，以其靈敏性、特異性和快速性在醫(yī)學(xué)和分子生物等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，由此可見核酸擴(kuò)增技術(shù)的重要性。近年來隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展以及生物物理技術(shù)的大量應(yīng)用，新的核酸擴(kuò)增模式也不斷涌現(xiàn)。已經(jīng)建立起來的方法大體可分為兩大類，靶核酸的直接擴(kuò)增與信號放大擴(kuò)增。前者包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、鏈替代擴(kuò)增（SDA）、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR）和依賴核酸序列的擴(kuò)增（NASBA）等，這些方法都具有很高的靈敏度。信號放大擴(kuò)增包括技術(shù)核酸（bDNA）、雜交捕獲、侵染(Invader)和通過擴(kuò)增替

3、代分子來檢測靶核酸等方法。而滾環(huán)增（RCA）是一種既能直接擴(kuò)增靶核酸，又能實(shí)現(xiàn)信號放大擴(kuò)增的方法。這些方法的區(qū)別見表1。表1  不同核酸擴(kuò)增技術(shù)的特性fig2058 BDNA：枝狀DNA,LCR：連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；NASBA：依賴性核酸序列的擴(kuò)增；PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；RCA：滾環(huán)擴(kuò)增：RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR; SDA: 鏈替代擴(kuò)增；SNP：單核苷酸多態(tài)性：TMA：轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增；Invader:侵染檢測技術(shù)   1 反應(yīng)（PCR）    在DNA擴(kuò)增方面,PCR一直是應(yīng)用最廣泛的方法。美國食品與與藥品管理局（FDA）已經(jīng)批準(zhǔn)一些

4、定量檢測病原體的PCR診斷試劑盒（Roche）,如HIV、結(jié)核分枝桿菌、沙眼衣原體等。研究報(bào)道這些試劑盒的應(yīng)用結(jié)果優(yōu)于bDNA、NASBA擴(kuò)增技術(shù)。    最近，PCR技術(shù)的最大突破就是對單管PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時熒光定量檢測，該方法提高了靈敏度與特異性，并且易于操作。如TaqMan就是采用這種技術(shù)，兩端分標(biāo)記有熒光與淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針結(jié)合到PCR產(chǎn)物上后，其淬滅基團(tuán)被具有5´-3´外切酶活性的Taq DNA聚合酶切掉，從而產(chǎn)生熒光，通過對熒光的實(shí)時動態(tài)檢測可對PCR產(chǎn)物進(jìn)生定性和定量。    TaqMan技術(shù)另一種應(yīng)用就是分子燈標(biāo)（

5、molecular beacon）。分子燈標(biāo)為一莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，其環(huán)狀區(qū)核苷酸序列與靶核酸互補(bǔ)，靠近兩端的部分序列互補(bǔ)構(gòu)成分子燈標(biāo)的莖部，兩末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)。沒有靶核酸存在時，分子標(biāo)保持莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光工團(tuán)與淬滅基因距離較近，產(chǎn)生的熒光能量根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理轉(zhuǎn)移到淬滅基團(tuán)，并以熱能的形式散發(fā)出去，從而檢測不到或僅有微弱熒光本底。當(dāng)靶核酸存在時，莖部結(jié)構(gòu)由于環(huán)狀部分結(jié)合靶序列而被打開，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，熒光產(chǎn)生。此技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于結(jié)核及大腸肝菌O：157的檢測。    Amplifluor是分子燈標(biāo)的另一種形式，以引物的形式用于PCR，其5&#

6、180;端為莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)并標(biāo)記有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)，當(dāng)Amplifluor被摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物中后，其莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開，產(chǎn)生熒光。Jordens等人將其應(yīng)用于HPV的分型檢測。同TaqMan中的分子燈標(biāo)相比，Amplifluor技術(shù)不足之處是不能區(qū)分特異性與非特異性的PCR產(chǎn)物。Scorpion為一修飾的Amplifluor，可以降低本底而優(yōu)于TaqMan和分子燈。三種形式的分子燈標(biāo)在應(yīng)用方面的不足之處就制備較困難，成本較高。2 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR）    在LCR中，一對寡核苷酸探針雜交到靶DNA的相鄰序列上，之間形成的缺口被連接酶所連接，再由連接產(chǎn)物的引物進(jìn)行溫度循環(huán)擴(kuò)增

7、。此方法的最大優(yōu)點(diǎn)就是可用檢測基因突變。FDA已批準(zhǔn)該類試劑盒 用于檢測沙眼衣原體，具有與PCR一致的檢測靈敏度。    LCR最近也被應(yīng)用于微陣列芯片。靶核酸被雜交捕獲后，等位基因特異性的探針被連接到一熒光標(biāo)記的探針，等位基因特異的探針在5´端有一段外加序列用來捕獲DNA微陣列上的LCR產(chǎn)物，從而對帶有熒光的產(chǎn)物進(jìn)行測定。這種技術(shù)結(jié)合了液相LCR的特異性與通用型陣列的多重性，進(jìn)一步拓寬了LCR的應(yīng)用。3 鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)（SDA）    little M等人結(jié)合SDA與實(shí)時熒光發(fā)了新一代DNA探針系統(tǒng)，即BDProbeTecET。采用標(biāo)記兩種不

8、同熒光基團(tuán)的探針，在SDA過程中，該探針被摻入到雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物中，由限制內(nèi)切酶的酶沏使淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)分開，從而釋放熒光。此系統(tǒng)用于病原體的檢測，最低可檢測到10-15個腦膜炎雙球菌或沙眼衣原體。    Westin L等人將SDA擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于微電子芯片中，在一個電場中，生物素標(biāo)記的引物被固定到微陣列上，另一電場中，靶核酸被雜交捕獲，并在原位進(jìn)行SDA反應(yīng)，產(chǎn)物在電場作用下被定引物捕獲。盡管擴(kuò)增與雜交捕獲過程中有信號喪失，但還是可以達(dá)到一定的靈敏度（104拷貝）。4 依賴核酸序列的擴(kuò)增（NASBA）    NASBA主要用來檢測HIV的病毒載量，最近不

9、同實(shí)驗(yàn)小組將其與其它檢測方法比較得出了不同的結(jié)果，看來對該方法有待進(jìn)一步的評價。5 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（TMA）    TMA是一種利用RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶等溫反應(yīng)條件下來擴(kuò)增RNA或DNA的系統(tǒng)。主要產(chǎn)品為Gen-Probe,其檢測沙眼衣原體與結(jié)核分枝桿菌的試劑盒已得到FDA批準(zhǔn)上市。最近研究表明，該方法用于HIV的定量檢測，靈敏度高于RT-PCR和bDNA方法。6 枝鏈核酸信號放大系統(tǒng)(bDNA)    該系統(tǒng)是目前本實(shí)驗(yàn)室的在研課題，其信號放大是通過堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的探針雜交結(jié)合到一個樹枝狀核酸枝狀體上而實(shí)現(xiàn)的。在條件穩(wěn)定的情況下，其檢測靈敏度

10、主要取決于信號的顯示體系。Chiron公司采用AP的發(fā)光底物1，2-二惡二酮（dioxetane），用發(fā)光檢測儀來測量其發(fā)光強(qiáng)度，靈敏度大大提高。    盡管RT-PCR是唯一FDA批準(zhǔn)用來定量分析血清HIV的技術(shù)，但bDNA方法在臨床實(shí)驗(yàn)室也是經(jīng)常利用的，并且最近的研究報(bào)道Bdna3.0在線性范圍上（100-500000拷貝/毫升）優(yōu)于RT-PCR。BDNA技術(shù)應(yīng)用的最大限制就是靈敏度不夠高（與PCR相比）。為了解決這個問題，Capaldi等人將DNA枝狀體作為一個反應(yīng)平臺，結(jié)合到技狀體上的寡核苷酸在DNA聚合酶作用下延伸和外切，產(chǎn)生大量的無機(jī)焦磷酸（ppi）,在酶促作用

11、下ppi可轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP，ATP可通過熒光素酶酶促產(chǎn)生熒光信號來定量。此方法靈敏度可達(dá)到5zmol(10-21mol),接近于PCR。7 雜交捕獲    Digene公司建立起來的這種方法的原理是將DNA-RNA的雜交信號在固相載體上轉(zhuǎn)化為免疫結(jié)合，由標(biāo)記AP的抗體介導(dǎo)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。被FDA批準(zhǔn)的該類型試劑盒有淋球菌、沙眼衣原體和巨細(xì)胞病毒，并且是唯一被批準(zhǔn)用來檢測人類乳頭瘤病毒DNA（HPV-DNA）的試劑盒。8 DNA裂解信號放大    在環(huán)狀探針技術(shù)中（cycling probe technology, CPT）,探針為一含DNA-RNA-DNA

12、的嵌合體，兩端分別標(biāo)記生物素與熒光蛋白，結(jié)合到靶核酸上后，RNA部分被RNA酶（H）降解，兩端DNA部分脫落下來，同時靶核酸可繼續(xù)用來結(jié)合探針。反應(yīng)后的體系在包被有鏈親合素與蛋白G抗體的高流速硝酸纖維素膜上層析，如果沒有靶核酸存在，完整的探針結(jié)合上膠體金-抗熒光蛋白接頭，被包埋的鏈親合素捕獲后產(chǎn)生一條檢測線，反之則沒有。最近該技術(shù)有用于耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌與耐萬古霉素的腸道微球菌的檢測。    侵染探針（Invader）技術(shù)為另一種DNA信號放大分析。它是依據(jù)AFEN1酶的酶切特性來設(shè)計(jì)上、下游引物，上游引物的全部序列與下游引物（信號探針）的3´部分序列

13、可與靶核酸的一段連續(xù)序列雜交結(jié)合，這樣下游引物的5´端就如同在上游引物的侵入下而呈翼狀探出，進(jìn)而被FEN1酶切下，分析酶切片段可確定有無靶核酸的存在。Hall等人使酶切下來大片段與按同樣原理設(shè)計(jì)的分子燈標(biāo)結(jié)合，后者經(jīng)FEN1酶切后熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，產(chǎn)生熒光。其檢測靈敏度可達(dá)1000拷貝（靶核酸）以下。    該技術(shù)還可應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性分析（single nucleotide polymorphism,SNP）,因?yàn)閴A基錯配可抑制FEN1的酶切。用于基因突變的研究報(bào)道結(jié)果與等位基因特異性PCR一致。9 滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）    RCA既

14、可進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增，也可進(jìn)行信號放大擴(kuò)增。有線性與指數(shù)兩種形式的RCA。線性RCA是引物結(jié)合到環(huán)狀DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸。產(chǎn)物是具有大量重復(fù)序列（與環(huán)狀DNA完全互補(bǔ)）的線狀單鏈。線性RCA用于靶核酸擴(kuò)增僅限于一些具有環(huán)狀核酸的病毒、質(zhì)粒和環(huán)狀染色體。    Schwetizetr等人建立了免疫RCA，引物的5´端標(biāo)記有抗體，抗原抗體反應(yīng)后，加入RCA反應(yīng)組分與環(huán)狀DNA模板進(jìn)行RCA，然后標(biāo)記有熒光素的探針與RCA產(chǎn)物原位雜交，最后對熒光信號進(jìn)行檢測，該方法的靈敏度可達(dá)0.1pg/ml。    指數(shù)RCA原理與線性RCA相同，采

15、用與環(huán)狀DNA序列完全一致的第二種引物，該引物與第一次線性RCA產(chǎn)物結(jié)合并酶促延伸，其產(chǎn)物又作為第一種探針的模板，這樣一來在很短的時間內(nèi)（1h），產(chǎn)物呈指數(shù)遞增。Thomas等人證實(shí)其靈敏度可達(dá)到10拷貝，在1h內(nèi)產(chǎn)物達(dá)107倍。    指數(shù)RCA可用于非環(huán)狀DNA的擴(kuò)增，設(shè)計(jì)一引物，其兩端可結(jié)合到一段連續(xù)的序列上，并形成缺口，在連接酶作用下，引物被連接成環(huán)狀。 此環(huán)狀引物可作為RCA的模板，進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。此方法特異性很高，可用于突變與SNP的檢測，若與熒光實(shí)時檢測系統(tǒng)結(jié)合起來，其應(yīng)用前景將是很廣的。10 納米顆粒（nanoparticles）    納

16、米材料是具有納米介觀尺度（0.1-100nm）的均勻的有機(jī)或無機(jī)分子。按一定方法合成的均勻的膠體金顆粒在該領(lǐng)域一直是倍受青睞的，此納米粒子在免疫標(biāo)記領(lǐng)域已占有一席之地，并發(fā)揮著巨大的作用。    膠體金顆?？膳c生物大分子表面的還原性的疏基結(jié)合。人工合成的寡核苷酸探針經(jīng)疏基修飾后就可被膠體金顆粒標(biāo)記上，可用于固相核酸雜交的信號顯示。液相雜交中，通過膠體金標(biāo)記的寡核苷酸探針與靶核酸的結(jié)合，使得膠體金顆粒聚集在一起而呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，根據(jù)顏色變化可判斷靶核酸的存在與否。    直徑介于納米水平的膠體金顆粒和半導(dǎo)體材料都具有一定的光學(xué)、電子學(xué)和材料學(xué)特性，這些特性使

17、得其在化學(xué)傳感器、分光光度、量子斑點(diǎn)、縮微圖象以及納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建等領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛。膠體金納米顆粒用于核酸雜交檢測也是本實(shí)驗(yàn)室在研課題之一，相信它將會同其它納米材料一樣在納米科技領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。 Southern blot 是一種常用的 DNA 定量的分子生物學(xué)方法。其原理是將待測的 DNA 樣品固定在固相載體（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相 DNA 的位置上顯示出雜交信號，通過檢測信號的有無、強(qiáng)弱可以對樣品定性、定量，從而計(jì)算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)。 Southern 法準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)，但存在費(fèi)時費(fèi)力的缺點(diǎn)。另外，由于 Southern 法檢測不經(jīng)過

18、靶片段的擴(kuò)增（ PCR ），一般每個電泳通道需要 10-30 g 的 DNA ，在實(shí)際操作中就需要較大量的植物材料來提取 DNA ，而轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織在無菌條件下經(jīng)過篩選、重新分化后一般都比較細(xì)弱，不宜大量取樣。如果外源基因在插入時發(fā)生基因重組，造成限制性酶切位點(diǎn)丟失， Southern 法也無法檢測到。這些因素都制約了 Southern 法在 T 0 代轉(zhuǎn)基因植物中檢測外源基因拷貝數(shù)的應(yīng)用。 實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)是一種較新的 DNA 定量方法。其定量的基本原理是在 PCR 反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如： SYBR GREEN I ）或特異性的熒光探針（如： Taqman 探

19、針），實(shí)時檢測熒光量的變化，獲得不同樣品達(dá)到一定的熒光信號（閾值）時所需的循環(huán)次數(shù)： CT 值（ Cycle Threshold ）；通過將已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 CT 值與其濃度的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以準(zhǔn)確定量樣品的濃度。熒光定量 PCR 技術(shù)具有簡便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效擴(kuò)增低拷貝的靶片段 DNA ，對每克樣品中 20pg-10ng 的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行有效檢測。同時，與 Southern 法相比，熒光定量 PCR 技術(shù)可對 T-DNA 的不同序列進(jìn)行擴(kuò)增，因此能實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因品系中的基因重組的檢測（ Giovanna 2002 ）。 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 BIOX.CN 2005-4-14 23

20、:55:00來源：生命經(jīng)緯 細(xì)胞凋亡的檢測方法眾多，流式細(xì)胞儀檢測凋亡，是常用的方法。由于流式細(xì)胞儀固有的特點(diǎn)可以準(zhǔn)確的進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)。因此，具有其它方法無可比擬的優(yōu)越性。下面我們就簡單明了地介紹流式在檢測凋亡方面的應(yīng)用。 下面是一幅凋亡過程圖。在凋亡誘導(dǎo)劑的作用下，首先是細(xì)胞色素C和apa f1形成復(fù)合體，線粒體的功能發(fā)生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰絲氨酸外翻，這時細(xì)胞的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生了改變，可以看到細(xì)胞變小，胞核皺縮；最后是細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂，形成凋亡小體。（圖1） 在凋亡發(fā)生的各個過程當(dāng)中，都有相應(yīng)的流式細(xì)胞儀的檢測方法，可以采用以下檢測方法：1、線粒體功能2、DN

21、A Cycle3、Caspases  4、Annexin V Assay5、DNA Fragmentation Assays（可以參閱 基本上涵蓋了細(xì)胞凋亡的各個期，對各種檢測方法的原理和特點(diǎn)做一個簡單介紹。線粒體功能檢測的試劑盒有深圳達(dá)科為公司代理的試劑盒（產(chǎn)品編號為BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒。其檢測主要采用陽離子型熒光染料。原理是：正常細(xì)胞中，染料可以在線粒體內(nèi)聚集，發(fā)出明亮的紅色熒光；而細(xì)胞凋亡后，其線粒體膜電位發(fā)生改變，染料無法進(jìn)入線粒體，只能在胞質(zhì)中以單體形式存在，發(fā)出綠色的熒光。可以在熒光顯微鏡下，或流式檢測。采用488nm激發(fā)，其

22、檢測波長分別是527nm和590nm。整個實(shí)驗(yàn)過程操作簡單，只需要30min就可以見到結(jié)果。Caspase家族可以檢測的分子非常多，也有不少商業(yè)的試劑盒可以應(yīng)用。即使沒有相應(yīng)的試劑盒，只要有相應(yīng)抗體基本上是可以檢測的，具體的方法是參照細(xì)胞內(nèi)蛋白檢測的步驟。在細(xì)胞凋亡過程中伴隨著一系列的形態(tài)特征改變，細(xì)胞膜的改變是這些特征中較早出現(xiàn)的一種。在凋亡細(xì)胞中，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外側(cè)。AnnexinV是一種3536 KD的鈣粒子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，它對PS具有較高的親和力。細(xì)胞凋亡時，可以和外翻的PS結(jié)合，從而可以檢測凋亡的細(xì)胞。發(fā)生死亡的細(xì)胞其細(xì)胞膜上的PS也外翻，

23、因而也會陽性。因此，常用的凋亡試劑盒除了采用AnnexinV標(biāo)記之外，還會加一種DNA染料，常用的有PI和7AAD，由于死亡的細(xì)胞膜通透性增高，染料可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和DNA結(jié)合，從而可以發(fā)熒光，區(qū)分出死細(xì)胞。下圖給出的是在使用FAS單抗誘導(dǎo)前后的檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)是Annexin-V FITC, 縱坐標(biāo)是PI，左上、右上、左下、右下四個象限中右上象限代表死亡的細(xì)胞，左下象限是存活的細(xì)胞，右下象限是凋亡的細(xì)胞。在采用Annixin V方法檢測凋亡細(xì)胞時，要特別強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)：該方法適用于懸浮生長的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測。對于貼壁生長的細(xì)胞，由于在胰酶等消化處理過程中會造成細(xì)胞膜的損傷，會造成較高的

24、假陽性，從而影響檢測結(jié)果。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細(xì)胞。我不推薦用該方法檢測。因?yàn)槠渲貜?fù)性較差，且需要操作時非常小心。（圖2）DNA周期檢測原本是用來反應(yīng)細(xì)胞各個期，即細(xì)胞增殖狀況的。利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料，如PI結(jié)合的特性。細(xì)胞各個時期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同，流式檢測的熒光輕度也不一樣。G2M期DNA含量是G0G1的兩倍，而S期介于兩者之間。但是由于發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞DNA含量較少，因而可以在細(xì)胞G0G1期前面有一個亞二倍體峰，從而認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。但是由于死亡的細(xì)胞本身其DNA含量也是減少的，因而非常難于區(qū)分凋亡和死亡的細(xì)胞。在90年代，

25、該方法曾經(jīng)風(fēng)靡一時，現(xiàn)在看來，那時的實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要推敲。盡管，經(jīng)典的流式檢測資料給出的圖是認(rèn)為凋亡的細(xì)胞是緊挨著G0G1期峰的一個峰，死亡的細(xì)胞峰離G0G1期峰較遠(yuǎn)，但是這種典型的結(jié)果似乎很難獲得。有其它的替代方法，完全可以不用這種方法。下圖橫軸代表PI的熒光強(qiáng)度，縱軸代表細(xì)胞數(shù)目，各個期根據(jù)熒光強(qiáng)度可以簡單的進(jìn)行區(qū)分。（圖3）晚期凋亡的細(xì)胞由于DNA的斷裂，因而可以出現(xiàn)DNA ladder，從而也就有了經(jīng)典的檢測方法TUNEl。流式也能進(jìn)行Tunel檢測，其檢測原理與經(jīng)典Tunel原理基本一致。以BD公司的為例，其利用TdT能將熒光素標(biāo)記的dUTP標(biāo)記到斷裂的DNA末端，從而使凋亡的細(xì)胞具有熒

26、光。但是由于在細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記，細(xì)胞需要進(jìn)行固定處理，操作類似免疫組織化學(xué)法，容易造成假陽性。建議采用原裝大廠的試劑盒，并且嚴(yán)格的設(shè)立對照。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定后再進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)。標(biāo)本處理后，均可以用熒光纖維鏡進(jìn)行觀察，拍照。流式檢測后，可以進(jìn)行精確的計(jì)算凋亡百分比。這一點(diǎn)，經(jīng)典TUNEl是做不到的。（圖4）流式細(xì)胞儀的工作原理 BIOX.CN 2005-6-3 15:14:06來源：儀器分析網(wǎng) （1）參數(shù)測量原理：流式細(xì)胞計(jì)可同時進(jìn)行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區(qū)進(jìn)行的，所謂測量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點(diǎn)。液流中央的單個細(xì)胞通過測量區(qū)時，受到

27、激光照射會向立體角為2的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因?yàn)檫@些生物學(xué)參數(shù)又和細(xì)胞對光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細(xì)胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經(jīng)染色活細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。經(jīng)過固定的和染色處理的細(xì)胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號當(dāng)然不同于活細(xì)胞。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。在流式細(xì)胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：前向角（即0。角）散射（FSC）；側(cè)向散射（SSC），又稱90。角

28、散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對同種細(xì)胞群體隨著細(xì)胞截面積的增大而增大；對球形活細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系；對于形狀復(fù)雜具有取向性的細(xì)胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測量主要用來獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，但它對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。在實(shí)際使用中，儀器首先要對光散射信號進(jìn)行測量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時，可鑒別出樣品中被染色和

29、未被染色細(xì)胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。熒光信號主要包括兩部分：自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；特征熒光，即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細(xì)胞化學(xué)等測量中，對于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關(guān)鍵。一般說來，細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；細(xì)胞樣品中所含亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。減少

30、自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：盡量選用較亮的熒光染料；選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)；采用電子補(bǔ)償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻(xiàn)予以補(bǔ)償。（2）樣品分選原理：流式細(xì)胞計(jì)的分選功能是由細(xì)胞分選器來完成的。總的過程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進(jìn)行分選的。穩(wěn)定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數(shù)百m。實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)公式f=v/4

31、.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細(xì)胞液滴在靜電場中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，一般為數(shù)十ms。精確測定延遲時間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來產(chǎn)生延遲?？筛鶕?jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。（3）數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析，至于對儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問題而

32、定。數(shù)據(jù)顯示：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（histogram）、二維點(diǎn)圖（dot plot）、二維等高圖（contour ）、假三維圖（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。直方圖是一維數(shù)據(jù)用昨最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般XY平面描圖儀給出的曲線。根據(jù)選擇放大器類型不同，橫座標(biāo)可以是線性標(biāo)度或?qū)?shù)標(biāo)度，用“道數(shù)”（Channel No .）來表示,實(shí)質(zhì)上是所測的熒光或散射光的強(qiáng)度?？v座標(biāo)一般表示的是細(xì)胞的相對數(shù)。二維點(diǎn)圖能夠顯示兩個獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對數(shù)之間的關(guān)系。橫座標(biāo)和縱座標(biāo)分別為與細(xì)胞有關(guān)的兩個獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個點(diǎn)表示同時

33、具有相應(yīng)座標(biāo)植的細(xì)胞存在（圖10-3）?？梢杂啥S點(diǎn)圖得到兩個一維直方圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點(diǎn)圖的信息量要大于二個一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個細(xì)胞具有相同的二維座標(biāo)在圖上只表現(xiàn)為一個點(diǎn)，這樣對細(xì)胞點(diǎn)密集的地方就難于顯示它的精細(xì)結(jié)構(gòu)。二維等高圖類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點(diǎn)圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細(xì)胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。假三維圖是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對二維等高圖的一種視覺直觀的表現(xiàn)方法。它把原二維圖中

34、的隱座標(biāo)細(xì)胞數(shù)同時顯現(xiàn)，但參數(shù)維圖可以通過旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)，這無疑是有助于對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的。數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類。當(dāng)被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來自所測的數(shù)據(jù)。例如在測定老鼠精子的DNA含量時，可以獲取細(xì)胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來描述這些數(shù)據(jù)，則參數(shù)即為面積、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用最小二乘法。而非參數(shù)分析法對測量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè)，即采用無設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很

35、簡單，只需要直觀觀測頻數(shù)分布；也可能很復(fù)雜，要對兩個或多個直方圖逐道地進(jìn)行比較。逐點(diǎn)描圖（或用手工，或用描圖儀、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)）是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們?？梢杂脕砹私鈹?shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計(jì)分析的模型、顯示最終結(jié)果等。事實(shí)上，不經(jīng)過先對數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀觀察分析就決不應(yīng)該對這批數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值分析。從這一點(diǎn)來看，非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異，特別是對照組和測試組?？紤]到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組、陰性對照組、或零時刻對照組等，具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實(shí)驗(yàn)要求而定。對照組和測試組的逐道

36、比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進(jìn)行比較時對曲線的總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化處理，甚至對兩條曲線逐道相減而得到“差結(jié)果曲線”往往是適宜的PCR技術(shù)的原理與方法（1）2007-5-1 17:23:43信息來源：來源網(wǎng)絡(luò) · PCR技術(shù)的原理與方法（1） 生物谷 網(wǎng)站 PCR定義PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。可用于基

37、因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。PCR技術(shù)的基本原理一.PCR反應(yīng)成分：1.模板DNA；2.引物；3.四種脫氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反應(yīng)緩沖液、Mg2 等。二.PCR反應(yīng)基本步驟：1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（55，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（7072，3060s）1.變性(denaturation)：通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過程。 2.退火(annealling)：當(dāng)溫度降低時，引物與模板DN

38、A中互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合成雜交分子。 3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按53方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補(bǔ)的DNA子鏈。 以上述三個步驟為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個循環(huán)的模板，經(jīng)過n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。 PCR擴(kuò)增的基本方法 PCR技術(shù)的原理與方法（2）2007-5-1 17:26:11信息來源：來源網(wǎng)絡(luò) · PCR技術(shù)的原理與方法（2） 生物谷 網(wǎng)站 PCR反應(yīng)的成分和作用 總體積：一般為25l100 l （一）無Mg2 buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)

39、反應(yīng)體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度，但不能超過50 mmol/L，否則會抑制DNA聚合酶活性。 （二）Mg2 :終濃度為1.52.0mmol/L，其對應(yīng)dNTP為200 mol/L，注意Mg2 與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq酶竟?fàn)嶮g2 ，當(dāng)dNTP濃度達(dá)到1 mmol/L時會抑制Taq酶的活性。 Mg2 能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。 （三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起著減少PCR管對Taq酶的吸附作用，對Taq酶有保護(hù)作用。 （四）底物（dNTPs）：dNTPs具有較強(qiáng)酸性，其儲存液用NaOH調(diào)pH值至7.07.5，一般存儲濃度為 10

40、 mmol/L，各成份以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為20200mol/L。高濃度可加速反應(yīng)，但同時增加錯誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會降低。（五）Taq酶：能耐95高溫而不失活，其最適pH值為8.38.5，最適溫度為7580，一般用72。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)，按53方向逐個將dNTP分子連接到引物的3端，合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。無35的外切酶活性，沒有校正功能。某種dNTP或Mg2 濃度過高,會增加其錯配率。用量一般為0.55個單位/100l。（六）模板：PCR對模板DNA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存

41、在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。 模板DNA的量不能太高，否則擴(kuò)增可能不會成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。 （七）引物：引物濃度一般為0.10.5mol/L，濃度過高會引起錯配和非特異擴(kuò)增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般1530個堿基，引物過長或過短都會降低特異性。其3末端一定要與模板DNA配對，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸）。 引物G C約占4555%，堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。 PCR反應(yīng)條件的選擇（影響因素）溫度參數(shù)： 1.變性：模板變性完全

42、與否是PCR成功的關(guān)鍵，一般先于94（或95）變性310min，接著94變性3060s。 2.退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5。引物長度在1525bp可通過公Tm=(G C)×4 (A T)×2計(jì)算退火溫度，一般退火溫度在4060之間，時間為3045s。如果(G C)低于50%，退火溫度應(yīng)低于55。較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。   3.延伸：延伸溫度應(yīng)在Taq酶的最適溫度范圍之內(nèi)，一般在7075。延伸時間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長度確定，通常對于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。 循環(huán)數(shù)： PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA

43、的量決定，一般2030次循環(huán)數(shù)較合適，過多的循環(huán)數(shù)會增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過預(yù)試驗(yàn)確定。 PCR產(chǎn)物積累規(guī)律： 反應(yīng)初期產(chǎn)物以2n呈指數(shù)形式增加，至一定的循環(huán)數(shù)后，引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡，產(chǎn)物進(jìn)入一個緩慢增長時期（“停滯效應(yīng)”），即“平臺期”。到達(dá)平臺期所需PCR循環(huán)數(shù)與模板量、PCR擴(kuò)增效率、聚合酶種類、非特異產(chǎn)物竟?fàn)幱嘘P(guān)。  PCR擴(kuò)增儀PCR常見問題 一.沒有擴(kuò)增產(chǎn)物 1.循環(huán)溫度：變性溫度、退火溫度 2.引物設(shè)計(jì) 3.DNA聚合酶活性 4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合 酶活性的成份) 5、DNA樣品 二.非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀 1

44、.Mg2 濃度 2.調(diào)整引物、模板、聚合酶的用量 3.適當(dāng)減少循環(huán)數(shù) 4.適當(dāng)提高退火溫度，縮短退火或延伸時間 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法信息來源：本站原創(chuàng)更新時間：2005-10-22 13:04:09 一、核酸分子雜交技術(shù)1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術(shù)的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，核酸自動合成儀的誕生，大大豐富了核酸探針的來源，新的核酸分子雜交類型和方法

45、不斷涌現(xiàn)。按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交有菌落原位雜交（colony in situ hybridization）、斑點(diǎn)雜交法（Dot blot）、Southern印跡雜交（Southern blot）、Northern印跡雜交（ Northern blot）和組織原位雜交（Tissue in situ hybridization），即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細(xì)胞化

46、學(xué)技術(shù)。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等。二、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（In situ hybridization），如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。菌落雜交系細(xì)菌裂解釋放出DNA，然后進(jìn)行雜交。Southern印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印跡雜交法是用以檢測某一特定的RNA片段的。它們都只能證明該病原體、細(xì)胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位。1969年美國耶魯大

47、學(xué)Gall和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。與此同時，Buongiorno Nardelli和Amaldi, John及其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。Orth（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記

48、核酸探針進(jìn)行原位雜交。Bauman（1981）等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer（1982）報(bào)道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標(biāo)記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。 Pezzella（1987）創(chuàng)建了用磺基化DNA探針來做細(xì)胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆">克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對雜交結(jié)合的

49、探針進(jìn)行定位。本法的優(yōu)點(diǎn)是磺基化DAN探針標(biāo)記簡便，不需作缺口平移標(biāo)記，敏感度也較高。但自生物素和高辛標(biāo)記探針技術(shù)建立后，已有取而代之的趨勢。生物素標(biāo)記探針技術(shù)是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位。生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。這種生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶促生物素標(biāo)記技術(shù)。另一種叫光促生物素標(biāo)記核酸技術(shù)，該技術(shù)是用光敏生物素（Photobiotin）標(biāo)記核酸。目前應(yīng)用的光敏生物素有乙酸鹽和補(bǔ)骨脂素生物素，它們都是由三個

50、部分組成：光敏基團(tuán)、連結(jié)臂和生物素（圖20-1）。在強(qiáng)光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團(tuán)即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每100150個堿基才能標(biāo)記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度（Forster et al 1985）。近年來，地高辛（Digoxigonin）標(biāo)記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。Boeringer Mannhem Biochemisca于1987年將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場。和其它非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時間。同時在敏感性和質(zhì)量

51、控制方面比生物素標(biāo)記技術(shù)要優(yōu)越，可以檢測出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標(biāo)記法顯示的顏色為紫藍(lán)色（標(biāo)記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)），有較好的反差背景。核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等。DNA探針還有單鏈DNA（Single stranded, ssDNA）和雙鏈DNA（Double stranded, dsDNA）之分（詳見十九章）。早期應(yīng)用的主要是DNA探針，繼之Temin在70年代研究致癌RNA病毒時制備了cDNA探針（complementary DN

52、A），其基本原理是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）又稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。CDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。RNA探針是將特異性的 cDNA片段插入含有相當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄性載體。這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟動子在多克隆位點(diǎn)的各側(cè)。Psp64和pSP65在sP6啟動子的多克隆位點(diǎn)的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄

53、RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（Sense probe）和與mRNA互補(bǔ)的反義RNA探針（antisense probe），又稱互補(bǔ)RNA探針（complementary RNA probe , cRNA）。通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對照。由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)極高。有報(bào)告認(rèn)為其雜交率高于DNA探針的8倍。 DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優(yōu)點(diǎn)，也可進(jìn)行放射性與非放射性標(biāo)記，但其特異性不

54、如克隆性探針強(qiáng)，亦不如其雜交信號高。原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在近20年的發(fā)展可以說是飛躍的，其突出的特點(diǎn)是由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加，探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了，更重要的是非放射性標(biāo)記物的發(fā)展使原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在不久的將來將和現(xiàn)今的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一樣成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。新的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。 Coulton（1991）建議將非放射性標(biāo)記技術(shù)更名為親合復(fù)合物標(biāo)記技術(shù)（Affinity Complex Labelled Probes, ACLP ）。因?yàn)椤胺牵?non）“在英文里是一個否定的名詞，而且根據(jù)非放射性標(biāo)記技術(shù)的原理是將一個標(biāo)記物

55、利用其親合性，應(yīng)用直接或間接的方法結(jié)合在核苷酸分子上。原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)的研究中可視為一項(xiàng)革命性的技術(shù)。它使它們的研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平。為各個學(xué)科的研究帶來突破性的進(jìn)展。其中特別突出的是細(xì)胞或組織的基因表達(dá)、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)。我們在下節(jié)將詳加敘述。三、位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法如前所述，由于核酸探針的種類和標(biāo)記物的不同，在具體應(yīng)用的技術(shù)方法上也各有差異，但其基本方法和應(yīng)用原則大致相同。大致可分為：雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；雜交；雜交后處理；顯示（visualization）：包括放射性

56、自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。a) 固定原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結(jié)果時應(yīng)考慮到取材至進(jìn)

57、入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細(xì)胞或組織。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouins固定劑也能獲得較滿意的效果。對于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中12h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70。如冰箱溫度恒定，在-70可保存數(shù)月之

58、久不會影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。其它固定劑如應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優(yōu)缺點(diǎn)，如沉淀性（Precipitating）固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouins液、Carnoys液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認(rèn)為ISHH較為理想的固定劑。b) 玻片和組織切片的處理1玻片的處理玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放由于ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應(yīng)用，以保證在整個實(shí)驗(yàn)過程中切片