分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-考題(共3頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上裝 訂 線 考試科目：現(xiàn)代分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)考試時(shí)間：120分鐘 試卷總分100分一、名詞解釋（本大題共5小題，每小題3分，總計(jì)15分）1、探針：能夠與靶分子特異結(jié)合的核酸分子，帶有供雜交后檢測(cè)的合適標(biāo)記物。2、顯色反應(yīng)：在IPTG的誘導(dǎo)下，載體可與宿主菌產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，此酶能使顯色底物X-gal分解成不溶于水的藍(lán)色化合物，從而使菌落變藍(lán)。若有外源片段插入此位點(diǎn)，則使載體的-半乳糖苷酶基因失活，不能形成有活性的-半乳糖苷全酶，X-gal不能被分解，菌落為白色。3、PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在聚合酶、引物、buffer、模板、dNTPs存在的條件下，經(jīng)過變性、退火

2、、延伸3步多個(gè)循環(huán)后，使模板上介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到大量復(fù)制。4、質(zhì)粒：獨(dú)立于染色體DNA之外的，能穩(wěn)定遺傳的共價(jià)閉合雙鏈DNA分子。5、BLAST：是基本的局部對(duì)比排列搜索工具（basic local alignment search tool）的簡(jiǎn)稱。可以從數(shù)據(jù)庫中找出與查詢序列的某些子序列相似的子序列。二、填空題（本大題共5小題，每小題3分，總計(jì)15分）1、染色體DNA、結(jié)構(gòu)的大小差異2、最快，最慢，中間3、3.24、乳糖，操縱子5、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度6、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、還具有濃縮效應(yīng)7、等電聚焦（IEF）二、簡(jiǎn)答題（本大題共4小題，每小題10分，總計(jì)

3、40分）1、 如有一核苷酸序列A，未知其功能，請(qǐng)用至少一種方法對(duì)其進(jìn)行初步地功能標(biāo)示。答：通過國際生物信息數(shù)據(jù)庫，如美國國立生物信息中心，對(duì)未知序列A進(jìn)行基本局部序列比對(duì)BLAST，找到與其同源性較高的序列，將其功能用來注釋未知序列（6分）。步驟如下：登錄,點(diǎn)擊BLAST網(wǎng)頁，在序列對(duì)話框內(nèi)粘貼序列A，點(diǎn)擊BLAST按鈕，等待其返回同源性結(jié)果，選擇含有mRNA序列的GenBank文件，將其功能作為未知序列的功能（10分）。2、 簡(jiǎn)述SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。 答：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）是目前用于測(cè)定蛋

4、白質(zhì)分子量最好的方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上，蛋白質(zhì)樣品可根據(jù)其分子大小、形狀以及所帶電荷多少等因素造成的電泳遷移率的差別而得到分離（4分）。SDS是一種強(qiáng)陰離子型去污劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，強(qiáng)還原劑例如巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，通過加熱使蛋白質(zhì)解離。解離后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克蛋白質(zhì)約克結(jié)合1.4g SDS。 由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電

5、荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)像的改變。（8分）蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)表明，它們?cè)谒芤褐械男螤睿朴陂L橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，而長軸則隨蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小成正比的變化。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的相關(guān)。因此，SDS-PAGE不僅可以分離蛋白質(zhì)，而且可以根據(jù)遷移率的大小測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。（10分）3、 列舉RNA提取的最關(guān)鍵的3個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，并說明其技術(shù)要求及注意事項(xiàng)。答：1）研磨，

6、液氮速凍，研磨充分，成粉末狀（2分）。注意加粉末時(shí)速度要快，不要使其融解。（4分） 2）吸上清，要小心（6分）。注意不要攪動(dòng)中間層，也不要吸到下層的有機(jī)層（8分）。3）干燥，不要過度，室溫5-10分鐘即可。注意不要讓沉淀掉下來。（10分）4）冰上操作，所有操作及離心均應(yīng)低溫進(jìn)行，防止Rnase的降解。（10分）以上只要答出3條即可，其它的關(guān)鍵步驟也可以。4、 如果經(jīng)PCR反應(yīng)后未獲得目的長度片斷或者特異性不強(qiáng)，從那幾個(gè)方面調(diào)整PCR程序以獲得特異性強(qiáng)的目的片斷？答：1）如果PCR未獲得目的片段，則應(yīng)降低退為溫度；適當(dāng)提高模板量；最后如果未獲得片段則重新設(shè)計(jì)引物，以獲得特異性強(qiáng)的目的片段（5分）

7、。 2）如果PCR后獲得的目的片段特異性不強(qiáng)，則應(yīng)提高退為溫度；適應(yīng)降低模板量；減少酶的用量；或者重新設(shè)計(jì)引物以獲得特異性強(qiáng)的目的片段（10分）。三、論述題（本大題共3小題，每小題15分，總計(jì)45分）1、 請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)克隆某一目的基因的主要實(shí)驗(yàn)過程并說明涉及的關(guān)鍵技術(shù)的原理及注意事項(xiàng)。答：1）如果該目的基因?yàn)橐阎?，且序列已知，則通過數(shù)據(jù)庫查到基因序列，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，PCR獲得全長，凝膠回收后，與載體連接、轉(zhuǎn)化、挑單克隆培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA，測(cè)序驗(yàn)證。（5分）2）如果該目的基因?yàn)樾虏牧现械幕?，且序列未知，則可通過數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源基因序列搜索，比對(duì)分析，根據(jù)同源性高的部分設(shè)計(jì)引物，PCR獲得片

8、段，測(cè)序得到部分序列，根據(jù)已知的部分序列設(shè)計(jì)GSP引物，利用RACE分別獲得5及3端序列，測(cè)序拼接成全長序列，再根據(jù)1）步的步驟獲得該目的基因。（10分）關(guān)鍵技術(shù)：引物設(shè)計(jì)，利用堿基互補(bǔ)原理，注意引物Tm值、GC%含量、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體、錯(cuò)配等。連接、轉(zhuǎn)化，利用Taq酶反應(yīng)加A的特性，與T載體可以互補(bǔ)，連接。轉(zhuǎn)化，則是利用互補(bǔ)顯色反應(yīng)原理，對(duì)陽性克隆進(jìn)行篩選。注意連接時(shí)目的片段與載體的摩爾比為5：1-10：1,一般16度過夜連接，轉(zhuǎn)化時(shí)注意感受態(tài)的制作和熱激時(shí)間50s左右。質(zhì)粒DNA提取則利用堿裂解法原理抽提，注意提取時(shí)蛋白要去除充分，RNA要消化干凈。RACE原理，根據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄時(shí)加

9、入接頭，利用GSP引物和接頭引物將目的片段擴(kuò)增出來。注意引物設(shè)計(jì)要長，Tm值要高。（15分）2、 請(qǐng)按照實(shí)驗(yàn)順序?qū)懗鯪orthern雜交的主要實(shí)驗(yàn)步驟并說明該步驟的注意事項(xiàng)。答：1）RNA提取，注意RNA純度要高，沒有DNA污染，且無降解。（2分）2）濃度測(cè)定，注意分光光度計(jì)測(cè)定時(shí)要充分混勻。3）凝膠電泳，上樣量要一致，電壓采用穩(wěn)壓電源，較低電壓，長時(shí)間5小時(shí)左右。（4分）4）轉(zhuǎn)膜，膠倒扣于濾紙上，膜和3MM濾紙比膠要稍小，放膜時(shí)要一次放好，膠周圍用封口膜封好，讓高鹽緩沖液只能從膠中間透過。（6分）5）干燥、固定，膜放在50度烘干30分鐘，然后短波紫外固定30秒。（8分）6）預(yù)雜交，用100度

10、變性的鮭精DNA，50度預(yù)雜交1小時(shí)。（10分）7）雜交，注意雜交液中加入100度變性的探針，50度過夜雜交。（12分）8）洗膜，注意洗膜時(shí)要換器皿，用到tween 20的地方，要清洗掉后再進(jìn)行下一步。（14分）9）顯影，加入顯色溶液CDP-STAR時(shí)要保持黑暗。（15分）3、 試論述從原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建到蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)需要考慮的因素。答：主要有以下方面：1）用PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行目的基因分離，在合成PCR引物時(shí)，要在PCR產(chǎn)物的兩端設(shè)計(jì)一定的限制性的酶切位點(diǎn)。經(jīng)酶切后克隆至用相同酶切的表達(dá)載體中。但根據(jù)實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對(duì)裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷。必須在酶切位點(diǎn)旁邊加上一個(gè)至幾個(gè)保護(hù)堿基，才能使所定的限制酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行有效切斷。（3分）2）將外源基因插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上時(shí)，要一定在開放閱讀框內(nèi)防止移碼。（6分）3）宿主菌：克隆的宿主菌：DH5a、JM109。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率高，質(zhì)粒產(chǎn)量高表達(dá)的宿主菌：BL21(DE3)