梁毅胡蘿卜ATP9基因

1、胡蘿卜atp9基因的克隆表達及細胞質雄性不育的相關性張智1,2，梁毅1，丁海鳳1，張洪偉1,(1北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心，北京 100097；2山西農(nóng)業(yè)大學，山西 太谷 030800；)摘 要：細胞質雄性不育是一種受細胞核和細胞質共同控制的母性遺傳性狀，它是由線粒體基因重組而形成的異常開放閱讀框的表達而引起，因此，線粒體基因的突變情況研究在細胞質雄性不育研究中具有重要的意義。本研究以胡蘿卜及其他植物atp9基因序列信息設計引物，分離并克隆了胡蘿卜細胞質雄性不育相關的線粒體基因片段，并利用半定量RT-PCR和Real

2、-time PCR技術研究了該基因在不育系和相應保持系中的表達情況。結果表明，與保持系相比，atp9基因在不育系中發(fā)生了若干堿基的置換及缺失；基因表達分析表明，不育系atp9基因在花蕾的前三個發(fā)育時期表達量明顯較低，并在大花蕾期超過了保持系，但是在盛花期其表達量又低于保持系。推測atp9基因的結構變異和異常表達與胡蘿卜細胞質雄性不育有著密切關系。關鍵詞：胡蘿卜；細胞質雄性不育；RT-PCR；實時熒光定量PCR中圖分類號：S631.2 文獻標志碼：ACloning and expression of atp9 gene in carrot and its relationship to cyto

3、plasmic male sterility基金項目：十二五國家科技支撐“主要蔬菜雜種優(yōu)勢利用與新品種選育”（2012BAD02B00）；北京市科委育種平臺三期“蔬菜高效育種技術研發(fā)與重大品種選育”（D111100001311002）；科技支撐項目“主要蔬菜良種繁育技術集成與產(chǎn)業(yè)化”（2011BAD35B07）;北京市常規(guī)育種財政專項“蔬菜種質資源的收集保存和評價利用”（2012-509）。第一作者簡介：張智，男，1980年出生，碩士研究生，TelE-mail: zhangzhi_zz。通訊作者簡介：梁毅，男，1969年出生，副研究員，從事胡蘿卜、洋蔥遺傳育種研究，

4、TelE-mail: liangyi222。ZHANG Zhi1, 2, LIANG Yi1, DING Hai-feng1, ZHANG Hong-wei1(1Beijing Vegetable Research Center of Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops in North China, Beijing JingYan YiNong Sci-

5、Tech Developent Center, Beijing 100097, China ; 2Shanxi Agriculture University, Taigu 030800, China)Abstract: Cytoplasmic male sterility controlled by both nucleus and cytoplasm is a trait of maternal inheritance which caused by expression of abnormal open reading frame formed as mitochondrion gene

6、recombination. Consequently, the study of mitochondrion gene mutation plays an important role in cytoplasmic male sterility research. In this study, specific primers were designed according to the atp9 gene in carrot and other plants, carrot mitochondrion gene fragments associated with cytoplasmic m

7、ale sterility were cloned either. The result indicates that carrot atp9 gene contains a many base pairs substitution and deletion in sterile line compares with maintainer line. The expression analysis using semi-quantitative RT-PCR and Real-time PCR demonstrates that expression of atp9 gene in carro

8、t sterile line is significantly lower than in maintainer line besides the big bud stage. These researches indicated that atp9 gene mutation and its abnormal expression has a closely relationship with carrot cytoplasmic male sterility.Key words: carrot; Cytoplasmic male sterility; RT-PCR; Real-time P

9、CR細胞質雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility，CMS）是受細胞核和細胞質共同控制的一種母性遺傳性狀1,2，其遺傳方式不符合孟德爾遺傳規(guī)律。其中，胡蘿卜雄性不育可分為兩種類型，即瓣化型雄性不育和褐藥型雄性不育。“瓣化型”雄性不育植株表現(xiàn)為花藥異變?yōu)榛ò昊蝾愃苹ò甑慕Y構而不能產(chǎn)生功能性的花粉，其雄蕊畸變的程度有所不同；而“褐藥型”雄性不育最初用于雜交育種。目前大多數(shù)的細胞質雄性不育雜交種都屬于瓣化型。細胞質雄性不育是由線粒體基因重組而形成的異常開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF）表達引起的3。Levings和Pring4通過對玉米mtDNA與CM

10、S關系的研究發(fā)現(xiàn)其不育系和保持系mtDNA酶切圖譜區(qū)別明顯，即二系線粒體基因組存在著大量的差異；他們首次從分子水平上證明了細胞質雄性不育基因存在于mtDNA上。Chetrit等5在對美花煙草（Nicotiana sylvestris）原生質體的培養(yǎng)過程中，獲得了兩個CMS基因的突變體CMS 和CMS ，并發(fā)現(xiàn)兩突變體mtDNA均發(fā)生了長達50 kb大片斷的缺失，推測CMS可能是由mtDNA部分片段的缺失所造成。Wise等6在CMS玉米mtDNA中發(fā)現(xiàn)了長5 bp片段的插入，該片段的存在導致了線粒體基因序列發(fā)生移位，并產(chǎn)生了一個新的終止密碼子。Szklarczyk等7，8從胡蘿卜瓣化型雄性不育株

11、K826A和相應的保持系K831B中克隆到了atp9全長基因，命名為atp-sp1和atp-N1，分析表明，除ORF 229 bp的位置出現(xiàn)了核苷酸的置換外，二者的編碼區(qū)是完全一致的，即可育系植株該位置為終止密碼子TAA，而瓣化型不育系植株為CAA。本研究利用與CMS相關的胡蘿卜和其他植物線粒體atp9基因序列設計引物，以胡蘿卜“褐藥型”雄性不育系170A和相應保持系170B為實驗材料，克隆獲得了胡蘿卜兩系植物線粒體atp9基因完整ORF，并對兩基因片段及其編碼的多肽序列進行了一定的分析；另外，利用半定量RT-PCR技術和Real-time PCR技術對不同花蕾發(fā)育時期該基因的表達特征進行了研

12、究，為今后進一步的論證胡蘿卜雄性不育及其相關因素的關系提供了科學依據(jù)。1 材料與方法1.1 實驗材料與試劑1.1.1 實驗材料與處理高代純合的“褐藥型”胡蘿卜細胞質雄性不育系170A及其相應保持系170B，由本課題組保存。取兩系胡蘿卜新鮮的幼嫩葉片為材料，用以提取mtDNA并克隆目的基因；目的基因的表達特征分析以兩系胡蘿卜不同發(fā)育時期的花蕾（以花萼的裂開程度為依據(jù)分為以下6個時期：花萼緊閉，現(xiàn)蕾前期；花萼裂開0.02 mm，小花蕾；0.02 mm花萼裂開0.05 mm，中花蕾；0.05 mm花萼裂開0.1 mm，大花蕾；0.1 mm花萼裂開0.15 mm，現(xiàn)花期；花萼裂開0.15 mm，盛花期

13、）為材料。取樣后分別用錫箔紙包好，液氮速凍后，于-80 保存?zhèn)溆谩?.1.2 主要試劑Trizol試劑和Superscript II Transcriptase購于Life Technologies（原Invitrogen）；RNase Free DNase I和poly-dT18 primer購于寶生物工程(大連)有限公司；RealMasterMix(SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司。1.2 方法1.2.1 胡蘿卜mtDNA提取以胡蘿卜不育系和保持系的幼嫩葉片為材料，提取mtDNA。具體方法參照張智胡蘿卜葉片mtDNA提取方法9。1.2.2 胡蘿卜總RNA的提取及反轉錄

14、合成單鏈cDNA 利用Trizol試劑提取不育系和保持系胡蘿卜花蕾各發(fā)育階段的總RNA，并用RNase Free DNase I處理該RNA，以去除殘留的基因組DNA。取1.0 L總RNA，使用Superscript II Transcriptase和poly-dT18 primer合成胡蘿卜的cDNA第一鏈，具體操作步驟參照說明書。1.2.3 胡蘿卜線粒體atp9基因片段克隆及序列分析利用Primer Premier 5.0，根據(jù)與CMS相關的胡蘿卜及其他植物線粒體atp9基因序列，設計特異性引物atp9-S：5-GCCAACATTGACTGACTTTC-3和atp9-A：5-TTACTTT

15、ACCCGGTTCCTAA-3。以胡蘿卜mtDNA為模板，擴增其線粒體atp9基因，反應體系為：胡蘿卜mtDNA，2 L；10×PCR Buffer，2 L；atp9-S（5 mol/L），1 L；atp9-A（5 mol/L），1 L；dNTPs（2.5 mmol/L），1.6 L；Taq酶（2.5 U/L），0.2 L；滅菌水補足20 L。反應程序為：94 預變性5 min；94 變性1 min，56 復性1 min，72 延伸1 min，共30個循環(huán)；72 延伸7 min。取上述PCR反應產(chǎn)物5 L，以1%膠濃度進行瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收目的基因條帶；回收的PCR產(chǎn)物克隆到

16、PGEM-T載體上，并將篩選的陽性克隆委托上海生工測序。利用DNASTAR和DNAMAN軟件分析目的基因的序列特征、開放閱讀框及其編碼蛋白質的氨基酸組成；利用在線工具NCBI（/guide/data-software/）和ExPASy Proteomics Server（/tools/blast/）等進行蛋白質結構功能域、同源氨基酸序列比對以及其他生物信息學分析。1.2.4 胡蘿卜線粒體atp9基因的表達特征分析根據(jù)克隆到的atp9基因序列設計了一對特異引物atp9-F：5-TCCGGCACCTATTGA

17、TTTTG-3（上游引物）和atp9-R：5-GACGAGAGGAGGGGAAGAGT-3（下游引物）。以三磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）為內標（上游引物為GAPDH-S：5-TTGGGAAAAAGGAGGAGGAT-3，下游引物為GAPDH-A：5-CGAGAAGAACAGAAAGGGGA-3），上述提取的cDNA第一鏈為模板，分別對保持系和不育系胡蘿卜的花蕾各個發(fā)育時期atp9基因進行了半定量RT-PCR分析和實時熒光定量PCR分析。半定量RT-PCR的反應程序為：94 預變性3 min；94 變性30 s，56 復性45 s，72 延伸45 s，共28個循環(huán)；72 延伸10 min。

18、實時熒光定量PCR分析采用試劑盒RealMasterMix(SYBR Green)來進行，其反應體系為：2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution，4.5 L；上游引物，0.25 L；下游引物，0.25 L；cDNA模板，1 L；加滅菌水至10 L。實時熒光定量PCR反應采用Light Cycler system（Roche LightCycler480實時熒光定量PCR儀）進行，基因的相對表達量計算采用2-Ct法10。2 結果與分析2.1 胡蘿卜atp9基因片段的克隆與分析利用胡蘿卜和其他植物線粒體atp9基因的序列設計引物，以胡蘿卜不育系和相應

19、保持系mtDNA為模板進行PCR反應。經(jīng)電泳檢測發(fā)現(xiàn)兩系mtDNA經(jīng)PCR反應后出現(xiàn)大小不同的特異性條帶，其中不育系特異條帶約為600 bp，而保持系約為650 bp（圖1）。將兩個DNA片段分別與載體連接并轉化大腸桿菌后，以通用測序引物T7和SP6對重組質粒進行了PCR檢測，并選取其中的陽性克隆進行測序檢測，發(fā)現(xiàn)在不育系170A中克隆的序列長度為598 bp，而在保持系170B中長度為640 bp。atp9-170A包含一個長270 bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼長89個氨基酸的多肽；而atp9-170B同樣包含一個長270 bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼含89個氨基酸的多肽鏈。

20、蛋白質的結構域分析結果表明，不育系和可育系包含有相同的結構域(圖2)。2.2 胡蘿卜atp9基因序列比對將所獲得的兩個DNA片段進行blastn分析，發(fā)現(xiàn)測序所得片段確實是胡蘿卜線粒體atp9基因片段。而DNAStar、DNAMAN等軟件的分析，表明與保持系相比，不育系atp9基因的第52 bp、432 bp、458 bp和579 bp四個位置核苷酸發(fā)生了突變，且在509 bp-550 bp處發(fā)生了缺失，而保持系此處多了一段大小為42 bp的重復序列；此外，在胡蘿卜不育系中，該基因432 bp位點的終止密碼子TAA突變?yōu)镃AA，導致其比保持系多編碼了13個氨基酸。這種結構的變化暗示其可能與胡蘿

21、卜細胞質雄性不育有關（圖3)。M：Trans DNA Marker；A：模板170A擴增條帶；B：模板170B擴增條帶M：Trans DNA Marker；A：Amplification of 170A fragments；B：Amplification of 170B fragments圖1 胡蘿卜線粒體atp9基因片段的PCR擴增Fig. 1 PCR amplification of atp9 from carrot mtDNA圖2 atp9基因結構域分析Fig. 2 Conserved domain analysis of atp9 gene2.3 胡蘿卜atp9基因不育系蛋白序列同源性

22、比對通過對atp9-170B蛋白的blastp分析，發(fā)現(xiàn)其與蠶豆Adenylate kinase（Accession No：P69442）氨基酸序列一致性為68%。與芥菜ATPase subunit 9（Accession No：Q5I7E6）、胡蘿卜ATPase9（Accession No：Q94S27）和蘋果ATP synthase subunit 9（Accession No：Q37550）的相似性分別為68%、57%和54%。這些基因都屬于ATP合成酶第九亞組。為進一步分析這些蛋白質之間的系統(tǒng)進化關系，對這些蛋白質進行了系統(tǒng)進化分析和保守結構域比較分析，結果表明，atp9-170B蛋白

23、與胡蘿卜ATPase9、胡蘿卜F0-F1 ATPase subunit 9（Accession No：O79335）遺傳距離較近，而與蠶豆Adenylate kinase距離較遠，與蘋果ATP synthase subunit 9遺傳距離也較遠(圖4)。圖3 胡蘿卜不育系和可育系atp9基因核苷酸和蛋白序列比對Fig. 3 Alignment of atp9 gene and protein between carrot male sterile line 170A and fertile lines 170B同源蛋白以其NCBI登錄號命名，進化樹分枝長度表示氨基酸變化率，Bootstrap重

24、復1000次。Phylogenic tree is constructed using neighbor-joining method and its bootstrap factor is 1000 replicates. The proteins are designated according to its Accession No. The length of the branches refers to the variation rate of amino acids. 圖4 atp9及其同源蛋白的系統(tǒng)進化及結構域比較Fig. 4 Phylogenic Analysis of at

25、p9-related proteins and comparison of their domains2.4 atp9基因的表達特征分析以胡蘿卜不育系和相應的保持系花蕾為研究材料，通過半定量RT-PCR技術，分析了atp9基因在花蕾6個不同發(fā)育時期的表達含量變化。結果表明，不育系atp9基因在花蕾發(fā)育的前三個時期表達量明顯低于相應的保持系基因，而從大花蕾期開始，不育系atp9基因大量表達，甚至超過了相應保持系基因，但是到了盛花期再次降低，并低于保持系該基因的表達量(圖5)。M. Trans DNA Marker；A1-A6:6個時期不育系花蕾cDNA擴增條帶；B1-B6:6個時期保持系花蕾cD

26、NA擴增條帶；GAPDH：內參基因擴增條帶。M. Trans DNA Marker；A1-A6：Amplification of 170A floral buds cDNA；B1-B6：Amplification of 170B floral buds cDNA； GADPH：Amplification of reference gene.圖5 atp9基因的RT-PCR表達結果Fig.5 Semi-quantitative RT-PCR analysis of atp9 gene為進一步研究atp9基因與雄性不育的關系，采用實時熒光定量PCR技術對半定量RT-PCR結果進行了驗證。由實驗結果

27、可知：實時熒光定量PCR產(chǎn)物的溶解曲線均為單峰，說明PCR特異性高，引物設計合理；對于花蕾的前三個發(fā)育時期，保持系atp9基因的表達量均約為不育系2倍，而在大花蕾期，不育系atp9基因表達量達到最大，并超過了其相應保持系，但是在盛花期時其表達量又顯著低于保持系。另外，實時熒光定量PCR結果還表明了保持系atp9基因表達量基本穩(wěn)定（圖6）。實時熒光定量PCR結果與半定量PCR結果基本保持一致，可推測不育系atp9基因的異常表達很可能與細胞質雄性不育有著密切關系。3 討論本研究以胡蘿卜幼嫩葉片為材料，采集葉片后進行低溫暗處理，以使葉綠體和糖類充分降解，不僅省去了黃化苗的培育步驟，而且還大大縮短了m

28、tDNA的提取時間。本研究利用了蔗糖沉淀差速離心法，在線粒體DNA提取過程中，使用了DNaseI處理，從而消除了核基因DNA的污染。所得mtDNA結構完整、質量和產(chǎn)量高，為后續(xù)研究奠定了基礎。A：不同PCR產(chǎn)物片斷的溶解曲線分析；B：atp9基因的實時定量PCR分析A: Melting curves analysis of differential fragments; B: Real-time PCR of atp9 gene圖6 atp9基因的表達特征分析Fig. 6 Expression analysis of atp9 gene導致植物細胞質雄性不育的因素有很多，而各種植物中確定的與細

29、胞質雄性不育密切相關的基因也各不相同。由于細胞質雄性不育現(xiàn)象廣泛存在11，而迄今為止確定的與細胞質雄性不育密切相關的基因卻不多，涉及的植物也只有十幾種12，所有有關細胞質雄性不育基因的數(shù)據(jù)有限，以至于利用同源序列克隆雄性不育相關基因的方法地利用也受到了極大地限制。高等植物線粒體基因組的大小和結構在不同物種乃至同一物種不同植株之間都存在極大的差異，但線粒體基因組編碼的基因產(chǎn)物卻基本一致13,14。隨著測序技術的發(fā)展，目前大多數(shù)植物的線粒體基因組已測序完畢，如經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，油菜線粒體基因組最小，為221 kb，而最大的則為葫蘆線粒體基因組，為2700 kb15,16。目前，克隆到的細胞質雄性不育基因

30、均為線粒體嵌合基因，且一般都與線粒體編碼的功能基因緊密連鎖并且共同轉錄12。2000年，M. Szklarczyk和M. Oczkowski等7，在瓣化型胡蘿卜雄性不育研究中發(fā)現(xiàn)，atp9基因在保持系中比不育系多了42 bp的重復序列，而導致了不育系該基因編碼的蛋白質序列比相應的保持系多了13個氨基酸；他們通過RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因的表達量的降低，可能是導致雄性不育的原因。而本研究采用瓣化型雄性不育品種，及不同的實驗材料，同樣得出了相同的結論，因此推斷atp9基因在胡蘿卜雄性不育中起著關鍵性作用。參考文獻：1Chase C D. Cytoplasmic male sterility: a

31、 window to the world of plant mitochondrial-nuclear interactionsJ. Trends Genet, 2007, 23(2): 81-90.2Hanson M R, Bentolila S. Interactions of mitochondrial and nuclear genes that affect male gametophyte developmentJ. Plant Cell, 2004, 16(Suppl): S154-S169.3路鐵剛, 丁毅. 分子遺傳學M. 北京: 高等教育出版社, 2008: 83-84.4

32、Levings C S, Pring D R. Restriction endonuelease analysis of mitochondria DNA from normal and texas cytoplasmic male sterile maizeJ. Science, 1976, 193: 158-160.5Chetrit P, Rios R, Paepe R, et al. Cytoplasmic male sterility is associated with large deletions in the mitochondrial DNA of two Nicotiana

33、 sylvestris protoclonesJ. Curr Genet, 1992, 21(2): 131-137.6Wise R P, Pring D R, Gengenbach B G. Mutation to male fertility and toxin insensitivity in Texas(T)-cytoplasm maize is associated with a frameshift in a mitochondrial open reading frameJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84(9): 2858-2862.7Szklarczyk M, Oczkowski M, Augustyniak H, et al. Organisation and expression of mitochondrial atp9 genes from CMS and fertile carrotsJ. Theor Appl Genet, 2000, 100(2): 263270.8Bach I C, Olesen A, Simon P