細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)操作步驟

1、實(shí)驗(yàn)介紹細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將 Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上 下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)， 由于聚碳酸酯膜有通透性，下層 培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。實(shí)驗(yàn)步驟：1材料準(zhǔn)備：可拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8科m沒包被膠的（Coster和Corning公司的也較常用），Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板 24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的 Transwell小室 相配套，BD公司的Matrigel ,無血清DM

2、EM （1%胎牛血清）DMEM 1640培養(yǎng)基，DMEMS全 培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基（也可加到 20%i1清），無菌PBS棉簽，胰酶，4腦聚甲醛固定 液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（% （g/ml） PBS結(jié)晶紫）2步驟和流程基質(zhì)膠鋪板：用BD公司的Matrigel 1 : 8 （根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生 mmp勺量來決定）稀釋，包被 Transwell小室 底部膜的上室面，置 37c 30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。制備細(xì)胞懸液制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12-24h,進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用PBS洗1 2遍），

3、用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至 5X105/ml。接種細(xì)胞取細(xì)胞懸液100dl加入Transwell小室。24孔板下室一般加入 600 dl含20%FBS勺培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng) 12 48h （主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。24h較常見，時間點(diǎn)的選擇 除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。結(jié)果統(tǒng)計直接計數(shù)法，“貼壁”細(xì)胞計數(shù)， 這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后，可以附

4、著在膜的卜室側(cè)而不會掉到下室里面去，通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計數(shù)細(xì)胞。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。%吉晶紫染色20 min ,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。實(shí)驗(yàn)材料(1) Transwell chamber: 24-well, 仙 m pore membranes (Corning)(2)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：無血清培養(yǎng)基，10%血清培養(yǎng)基，PBS %EDTA(3)固定液：甲醇(4)染色液：Giemsa染液(5)封片劑：中性樹膠(6)其他：小銀子，棉棒，載玻片，蓋玻片

5、操作步驟(1)所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和 Transwell chamber 放在37c溫育；(2)待測細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細(xì)胞，用PBSft無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2X105 /ml ;(3)在下室(即24孔板底部)加入600 800小 含10%血清的培養(yǎng)基，上室 加入100150小 細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng) 24小時；(4)用銀子小心取出chamber-,吸干上室液體，移到預(yù)先加入約 800仙l甲醇的 孔中，室溫固定30分鐘；(5)取出chamber,吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800屋Giemsa染液的孔中，室溫染色15 30分鐘；(6)輕輕用清

6、水沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber,吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；(7)用小銀子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；(8)顯微鏡下取9個隨機(jī)視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果注意事項(1)根據(jù)待測細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為仙m孔徑(如AGSM胞)，如果細(xì)胞體積較大可以考慮用10- m孔徑；(2)根據(jù)待測細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時間。常規(guī)24-wellchamber接種細(xì)胞數(shù)約為25X104/well ,遷移時間1236小時；(3)由于Corning公司的24-Transwell內(nèi)含12個獨(dú)立的chamber,為了避免操作污染，每次實(shí)驗(yàn)

7、可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊 24孔普通培養(yǎng)板(Corning)；(4)如果細(xì)胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細(xì)胞無血清培養(yǎng)24小時獲得的 上清加50(i g/ml FN (Fibronectin ),具體可查閱相關(guān)文獻(xiàn)；(5)細(xì)胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；(6)固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜 表面上未遷移的細(xì)胞，以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細(xì)牙簽或小銀 子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；(7) Chamber膜上都無法標(biāo)記，操作時應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對照組；(8)充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(cell invasion a

8、ssay )實(shí)驗(yàn)材料(1) Matrigel (BD 5mg/ml) , -20 C 保存(2)其余材料同遷移實(shí)驗(yàn)操作步驟(1) Matrigel在4c過夜融化；(2)用4c預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋 Matrigel至終濃度1mg/ml,冰上操作；(3)在chamber上室底部中央垂直加入100 口 稀釋后的Matrigel , 37c溫育4-5小時使其干成膠狀；(4)后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)(1-8)。注意事項(1) Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提 前在4c預(yù)冷；(2)鋪膠時保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；(3)其他注意事項同遷移試驗(yàn)。其他Tr

9、answell做腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)的具體步驟 基質(zhì)膠準(zhǔn)備：將凍存于80度冰箱的BD matrigel 4 度過夜(24h),變成液態(tài)；(2)取300ul無血清培養(yǎng)基，加入 60ul (或50ug/每室)Matrigel ,混勻，(4 c操作，最好在冰浴上)，加入上室各100ul (3個室)；放入37c培養(yǎng)箱中，孵育4-5h ( >5h);此間經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn)“白色層”時，說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。注釋：無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按1: 5稀釋，每孔加50ul ,在37c培養(yǎng)箱中1-2h。(3)消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗 3次，計數(shù)，配成細(xì)胞懸液；(4)用無血清培養(yǎng)基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100u

10、l細(xì)胞懸液；(5)下腔室中加入 500ul含有20%FBS條件培養(yǎng)基；(6) 37c培養(yǎng)箱中，孵育 20-24h;(7)取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4 C；(8)加入結(jié)晶紫(染色或Giemsa染色(510min),室溫，PBS洗2遍，用棉球擦 去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察。遷移實(shí)驗(yàn)transwell在24孔板中浸泡1小時；消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基 洗2次，計數(shù)，配成 細(xì)胞懸液，每孔加入100ul細(xì)胞懸液；加藥刺激；下腔室中加入條件培養(yǎng)基或其他刺激因子；37c培養(yǎng)箱中，孵育20-24h ;取出transwell 用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4 C；PBS洗2遍，加入結(jié)晶紫（為 染色，室溫，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察計數(shù)10照相，記錄。侵襲實(shí)驗(yàn)取300ul無血清培養(yǎng)基 ，加入30ul （或50ug/ 每室）Matrigel ，混勻，（4 C 操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul （ 3個室）；放入37 C培養(yǎng)箱中，孵育4-5h（5h ）;消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗 3次，計數(shù)，配成 細(xì)胞懸液；用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel 洗1次；每孔加入100ul細(xì)胞懸液；下腔室中加入600ul無血清條件培養(yǎng)基；37 C 培養(yǎng)箱中，孵育20-24h ;取出transwell 用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，