生物信息學(xué)與PCR

1、第九章第九章聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng) （Polymerase Chain Reaction. PCR）評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)：* * PCR PCR是現(xiàn)今生物生命學(xué)科最關(guān)注、最愛用、是現(xiàn)今生物生命學(xué)科最關(guān)注、最愛用、 最歡迎的新技術(shù)。最歡迎的新技術(shù)。* * 被譽(yù)為：被譽(yù)為：2020世紀(jì)世紀(jì)8080年代出現(xiàn)的具有劃時(shí)代年代出現(xiàn)的具有劃時(shí)代 的、生命學(xué)科中革命性的新技術(shù)。的、生命學(xué)科中革命性的新技術(shù)。* * PCR PCR使生命學(xué)科發(fā)生變革，給生物醫(yī)學(xué)的發(fā)使生命學(xué)科發(fā)生變革，給生物醫(yī)學(xué)的發(fā) 展注入無(wú)限活力。展注入無(wú)限活力。* * 公認(rèn)公認(rèn)PCRPCR最具發(fā)展前景，最有生命力的一項(xiàng)最具發(fā)展前景，最有生命力的一項(xiàng)

2、 新技術(shù)。新技術(shù)。* * 最短時(shí)間獲諾貝爾獎(jiǎng)（最短時(shí)間獲諾貝爾獎(jiǎng)（86-9386-93年）。年）。* * 多么高的評(píng)價(jià)都不過分。多么高的評(píng)價(jià)都不過分。一、問題提出一、問題提出 背景背景: : 分子生物學(xué)、遺傳學(xué)的興起，分子生物學(xué)、遺傳學(xué)的興起， 反向生物學(xué)的誕生反向生物學(xué)的誕生 （核酸、遺傳物質(zhì)，基因型（核酸、遺傳物質(zhì)，基因型表型）。表型）。 共同障礙：共同障礙： 如何在短時(shí)間內(nèi)如何在短時(shí)間內(nèi)快速、獲足夠量、純凈的、快速、獲足夠量、純凈的、 特異的目的特異的目的DNADNA片段片段/ /基因供使用，可檢測(cè)?；蚬┦褂?，可檢測(cè)。 1 1基礎(chǔ)理論研究的需要基礎(chǔ)理論研究的需要 DNADNA重組、基因

3、克隆、重組、基因克隆、HGPHGP測(cè)序，探針制備測(cè)序，探針制備 2 2實(shí)際應(yīng)用的需要實(shí)際應(yīng)用的需要 基因工程（基因表達(dá)）、基因診斷、基因治基因工程（基因表達(dá)）、基因診斷、基因治 療，基因預(yù)防等給人類帶來希望。療，基因預(yù)防等給人類帶來希望。體內(nèi)體內(nèi)DNADNA的復(fù)制體系的復(fù)制體系 引物引物引物引物二、二、PCRPCR的基本概念的基本概念概念概念 由一對(duì)引物介導(dǎo)，在體外對(duì)特定由一對(duì)引物介導(dǎo)，在體外對(duì)特定DNADNA片段進(jìn)行片段進(jìn)行 快速、酶促、擴(kuò)增技術(shù)?？焖?、酶促、擴(kuò)增技術(shù)。 以擬擴(kuò)增的以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別分子為模板，以一對(duì)分別與模板與模板5 5末端和末端和3 3末端互補(bǔ)的寡核苷

4、酸片段為引末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重合成，重復(fù)這一過程，即可使目的復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。片段得到擴(kuò)增。PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)循環(huán)前提：前提：人工合成一對(duì)特定引物作向?qū)?，人工合成一?duì)特定引物作向?qū)В?始動(dòng)始動(dòng)DNADNA合成。合成。酶促：酶促：體外試管內(nèi)進(jìn)行酶促生化合成體外試管內(nèi)進(jìn)行酶促生化合成 （非化學(xué)合成）。（非化學(xué)合成）。靶子：靶子：特導(dǎo)擴(kuò)增目的靶序列（目的）。特導(dǎo)擴(kuò)增目的靶序列（目的）。高效：高效：極微量模板、百萬(wàn)倍擴(kuò)

5、增極微量模板、百萬(wàn)倍擴(kuò)增快速：快速：短時(shí)高速完成實(shí)驗(yàn)。短時(shí)高速完成實(shí)驗(yàn)。內(nèi)內(nèi) 涵：涵： 三、三、PCRPCR工作原理工作原理 PCRPCR的基本原理的基本原理 變性、復(fù)性、半保留復(fù)制變性、復(fù)性、半保留復(fù)制 PCRPCR過程：過程：3 3步曲步曲 + 1+ 1循環(huán)循環(huán) 高溫變性高溫變性 90909797 降溫退火降溫退火 45455555 適溫延伸適溫延伸 7272左右左右 反復(fù)循環(huán)反復(fù)循環(huán)變性延伸退火90 9540 6070 75 分四個(gè)階段講述其原理：分四個(gè)階段講述其原理：（一）高溫模板變性（一）高溫模板變性 制備好含有擴(kuò)增靶序列制備好含有擴(kuò)增靶序列/ /目的基因的樣品目的基因的樣品DNAD

6、NA （模板（模板DNADNA）。然后在高溫下（）。然后在高溫下（90 - 9590 - 95）使雙）使雙 鍵模板鍵模板DNADNA變性，解鏈，獲得單鏈模板變性，解鏈，獲得單鏈模板DNADNA，為，為DNADNA 合成作好準(zhǔn)備。合成作好準(zhǔn)備。（二）降溫引物退火（二）降溫引物退火 合成一對(duì)特導(dǎo)性引物，在合成一對(duì)特導(dǎo)性引物，在25 - 5525 - 55溫度下，溫度下， 引物與模板配對(duì)結(jié)合。引物與模板配對(duì)結(jié)合。引物的作用有三：引物的作用有三：定位、定向、定大小定位、定向、定大小 一對(duì)引物分別位不同模板一對(duì)引物分別位不同模板 DNADNA鏈上的靶序列的兩端，鏈上的靶序列的兩端， 兩條引物各自結(jié)合在不

7、同兩條引物各自結(jié)合在不同 的信息、非信息鏈上。的信息、非信息鏈上。 引物是通過嚴(yán)格堿基互補(bǔ)發(fā)揮識(shí)別、引物是通過嚴(yán)格堿基互補(bǔ)發(fā)揮識(shí)別、 結(jié)合和特異定位。結(jié)合和特異定位。 2 2定向：定向： DNADNA鏈有方向性從鏈有方向性從55端到端到33端，引物端，引物 結(jié)合也有方向性。結(jié)合也有方向性。 引物和模板引物和模板DNA 3DNA 3端結(jié)合，端結(jié)合， 以引物為起點(diǎn)的新合成鏈，以引物為起點(diǎn)的新合成鏈，55端鎖定。端鎖定。 遵循遵循DNADNA合成合成55端到端到33端的方向性，端的方向性， 引物只能引物只能33端延伸，端延伸， 兩條引物兩條引物33端均指向靶序列。端均指向靶序列。 在高溫模板變性反應(yīng)

8、體系中，加入過量（濃度大，在高溫模板變性反應(yīng)體系中，加入過量（濃度大，引物數(shù)量多）的一對(duì)引物，在較低溫下（引物數(shù)量多）的一對(duì)引物，在較低溫下（25 - 5025 - 50）大量的引物分別與各自相對(duì)應(yīng)的單鏈模板大量的引物分別與各自相對(duì)應(yīng)的單鏈模板DNADNA互補(bǔ)補(bǔ)互補(bǔ)補(bǔ)嚴(yán)格大堿基配對(duì)，由于引物量大，長(zhǎng)度小，其退火、嚴(yán)格大堿基配對(duì)，由于引物量大，長(zhǎng)度小，其退火、結(jié)合的速度遠(yuǎn)高于模板單鏈結(jié)合的速度遠(yuǎn)高于模板單鏈DNADNA之間的結(jié)合。之間的結(jié)合。3 3定大小定大小 引物決定兩條引物之間的靶序列長(zhǎng)度，一對(duì)引引物決定兩條引物之間的靶序列長(zhǎng)度，一對(duì)引物一旦設(shè)計(jì)合成，其擴(kuò)產(chǎn)物長(zhǎng)短不再變化。物一旦設(shè)計(jì)合成，其

9、擴(kuò)產(chǎn)物長(zhǎng)短不再變化。（三）適溫引物延伸（三）適溫引物延伸（適溫新鏈合成）（適溫新鏈合成） 加入選定的加入選定的DNADNA聚合酶，在其適宜溫度（聚合酶，在其適宜溫度（Taq Taq 酶為酶為65 - 7265 - 72）進(jìn)行）進(jìn)行DNADNA酶促合成反應(yīng)，反應(yīng)體系中的酶促合成反應(yīng)，反應(yīng)體系中的4 4dNTPdNTP（底物（底物A A、C C、G G、T T四種核酸），在引物四種核酸），在引物33端，端，在模板序列指導(dǎo)下，開始合成，即引物自在模板序列指導(dǎo)下，開始合成，即引物自5353端端延伸，合成一條與模板互補(bǔ)延伸，合成一條與模板互補(bǔ) 之新鏈。之新鏈。 反應(yīng)體系中反應(yīng)體系中DNADNA產(chǎn)量增加一

10、倍，（原模板產(chǎn)量增加一倍，（原模板+ +新合成新合成DNADNA，半保留復(fù)制），若以此產(chǎn)物，半保留復(fù)制），若以此產(chǎn)物DNADNA總量總量為模板重新合成反應(yīng)，新反應(yīng)體系中模板量實(shí)際為模板重新合成反應(yīng)，新反應(yīng)體系中模板量實(shí)際將增加一倍。將增加一倍。（四）循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增（四）循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增 重復(fù)前三個(gè)步驟，重復(fù)前三個(gè)步驟， 由于由于每次循環(huán)后產(chǎn)物可作為下一次反應(yīng)模板，每次循環(huán)后產(chǎn)物可作為下一次反應(yīng)模板，DNADNA總量和模板量均較上一次循環(huán)增加一倍，總量和模板量均較上一次循環(huán)增加一倍， 反復(fù)多次累積呈指數(shù)增加，如一分子反復(fù)多次累積呈指數(shù)增加，如一分子DNADNA成單鏈成單鏈后兩個(gè)模板，一次循環(huán)后變?yōu)楹髢?/p>

11、個(gè)模板，一次循環(huán)后變?yōu)? 2分子分子DNADNA，變性后，變性后有有4 4個(gè)單鏈模板，個(gè)單鏈模板，3030次循環(huán)的次循環(huán)的 2 23030呈呈百萬(wàn)倍增加百萬(wàn)倍增加。PCRPCR原理原理模版模版目的擴(kuò)增片段目的擴(kuò)增片段5533PCRPCR原理原理高溫模板變高溫模板變性性目的擴(kuò)增片段目的擴(kuò)增片段3355PCRPCR原理原理2.2.降溫引物退火降溫引物退火上游引物：上游引物：下游引物：下游引物：5335PCRPCR原理原理3.3.適溫引物延伸適溫引物延伸PCRPCR原理原理4.4.循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增) )高溫模板變性高溫模板變性PCRPCR原理原理2)2)降溫引物退火降溫引物退火PCRPCR原

12、理原理3)3)適溫引物延伸適溫引物延伸PCRPCR原理原理4)4)循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增 (1)(1)高溫模板變性高溫模板變性PCR原理(2)(2)降溫引物退火降溫引物退火PCRPCR原理原理(4)(4)循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增(3)(3)適溫引物延伸適溫引物延伸 DNADNA以指數(shù)形式擴(kuò)增以指數(shù)形式擴(kuò)增(2(2n n) )，其中長(zhǎng)片段以線性形式，其中長(zhǎng)片段以線性形式擴(kuò)增擴(kuò)增 (2n+2) (2n+2)，最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在兩個(gè)引物之間。，最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在兩個(gè)引物之間。預(yù)變性預(yù)變性(92-95(92-95 C,2-5m)C,2-5m)變性變性(92-95(92-95 C,30s)C,30

13、s) 復(fù)性復(fù)性(40-60(40-60 C,30s)C,30s) 延伸延伸(72(72 C,30-60s)C,30-60s) 總延伸總延伸(72(72 C,7m)C,7m)( (25-35)25-35)次次PCRPCR的一般過程：的一般過程：經(jīng)過經(jīng)過3030次的循環(huán)次的循環(huán), , 擴(kuò)增的擴(kuò)增的DNADNA片段可達(dá)片段可達(dá)100100萬(wàn)倍以上。萬(wàn)倍以上。2402401625625611411452222282 20 00 0短片段（單鏈）短片段（單鏈864 42 2長(zhǎng)片段（單鏈）長(zhǎng)片段（單鏈）128128646432321616總片段（單鏈）總片段（單鏈）循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)P

14、CR 循環(huán)循環(huán) 第一步第一步 加熱變性加熱變性靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533PCR PCR 循環(huán)循環(huán)- - 第二步第二步 引物與靶序列退火引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerasePCR PCR 循環(huán)循環(huán) - - 第三步第三步 - - 引物延伸引物延伸靶序列 靶序列BiotinBiotin第第1 1個(gè)個(gè) PCR PCR 循環(huán)完成后循環(huán)完成后 得到兩個(gè)拷貝的靶序列得到兩個(gè)拷貝的靶序列No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of

15、Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon3030次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量 PCRPCR每次循環(huán)擴(kuò)增一覽表每次循環(huán)擴(kuò)增一覽表 (n0)(n0)循環(huán)循環(huán) 起始模板起始模板 55端鎖定長(zhǎng)鏈端鎖定長(zhǎng)鏈 短鏈靶序列短鏈靶序列 總拷貝數(shù)總拷貝數(shù)

16、 0 20 2 0 0 0 0 2 2 1 1 2 2 2 2 0 0 4 4 2 2 2 2 4 4 2 8 2 8 3 3 2 2 6 6 8 8 16 16 4 4 2 2 8 8 22 22 32 32 20 20 2 2 40 40 10 105 5 2 220+120+1 n n 2 2 2n 2n 2 2n+1n+1-2n-2 2-2n-2 2n+1n+1 ( (恒定不變恒定不變) )( (線性增加線性增加)()(近似指數(shù)增加近似指數(shù)增加) () (指數(shù)增加指數(shù)增加) )從表中可知，從表中可知， l 2020次次PCRPCR循環(huán)后，反應(yīng)產(chǎn)物循環(huán)后，反應(yīng)產(chǎn)物DNADNA鏈拷貝數(shù)鏈拷

17、貝數(shù)2 22020 起始模板可略去不計(jì)，起始模板可略去不計(jì)，55端長(zhǎng)鏈數(shù)端長(zhǎng)鏈數(shù)4040個(gè)，只個(gè)，只占總數(shù)占總數(shù)40/240/220203.53.510-5.10-5.比例相當(dāng)小。比例相當(dāng)小。l 當(dāng)擴(kuò)增當(dāng)擴(kuò)增3030次后，其占比例更小，產(chǎn)物中次后，其占比例更小，產(chǎn)物中 99.99%99.99%均為目的靶序列短鏈。均為目的靶序列短鏈。l可能合成少量小于靶序列的短小片段。由于可能合成少量小于靶序列的短小片段。由于進(jìn)入下一循環(huán)后，引物結(jié)合不止，不可能大進(jìn)入下一循環(huán)后，引物結(jié)合不止，不可能大量擴(kuò)增。量擴(kuò)增。( (二二)PCR)PCR操作流程操作流程加酶后參加酶后參數(shù)數(shù)時(shí)間時(shí)間溫度溫度變性變性30(30

18、(1m1m）90 - 9590 - 95退火退火30 - 6030 - 6037 - 5537 - 55擴(kuò)增擴(kuò)增60 - 9060 - 9070 - 7570 - 75循環(huán)總次循環(huán)總次數(shù)數(shù)25 - 3025 - 30次次 5 5、PCRPCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)定（選擇與優(yōu)化）反應(yīng)參數(shù)的設(shè)定（選擇與優(yōu)化）PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多多 聚聚 酶酶Pfu DNA 多多 聚聚 酶酶引引 物物 和和 或或 和和* * 切記莫忘切記莫忘l 模板變性要充分，模板變性要充分，l 最好加酶前使模板充分變性最好加酶前使模板充分變性 變性成單鏈變性成單鏈

19、* * PCR PCR 反應(yīng)六要素反應(yīng)六要素 l 引物引物l 酶酶l dNTPl 模板模板l Mg2+l 緩沖液緩沖液（四）結(jié)果檢測(cè)（顯示）（四）結(jié)果檢測(cè)（顯示）l 一般采用瓊脂礦凝膠電泳一般采用瓊脂礦凝膠電泳- -澳化乙錠處理澳化乙錠處理紫紫外燈下觀察法、熒光顯示（外燈下觀察法、熒光顯示（PCR-EBPCR-EB法）法）l 注意設(shè)立嚴(yán)格對(duì)照：注意設(shè)立嚴(yán)格對(duì)照： DNA DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，分子量標(biāo)準(zhǔn)， 陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照， 陰性、空白對(duì)照陰性、空白對(duì)照l(shuí)更精確的方法：更精確的方法： PCR-blot PCR-blot（轉(zhuǎn)印后與已知探針、雜交）（轉(zhuǎn)印后與已知探針、雜交） PCR-LP PCR-L

20、P（產(chǎn)物標(biāo)記后作探針、雜交）（產(chǎn)物標(biāo)記后作探針、雜交） PCR-HPLC PCR-HPLC（分析吸收峰）（分析吸收峰） 套式套式PCRPCR（另設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)引物、擴(kuò)增更小片段）（另設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)引物、擴(kuò)增更小片段）五、五、PCRPCR兩個(gè)最關(guān)鍵因素兩個(gè)最關(guān)鍵因素引物、酶引物、酶（一）引物（一）引物l 引物是引物是PCRPCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR PCR 產(chǎn)物的特異性產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板取決于引物與模板DNADNA互補(bǔ)的程度?；パa(bǔ)的程度。l 理論上，只要知道任何一段模板理論上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，序列， 就能按就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用其設(shè)

21、計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCRPCR就可將就可將模板模板DNADNA在體外大量擴(kuò)增。在體外大量擴(kuò)增。 引物（引物（primerprimer）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的PCRPCR反應(yīng)需要反應(yīng)需要兩種引物，分別成為兩種引物，分別成為55端引物和端引物和33端引物，或稱為上游端引物，或稱為上游/ /正向引物和下游正向引物和下游/ /反向引物。反向引物。 通常通常DNADNA及及mRNAmRNA序列的寫法為序列的寫法為5353，所以，所以55端引物與端引物與目的序列的目的序列的55末端序列相同，而末端序列相同，而33端引物與目的序列的端引物與目的序列的33末端序列反

22、向互補(bǔ)。末端序列反向互補(bǔ)。引物引物 它們作為它們作為DNADNA擴(kuò)增的起始部分，能限定待擴(kuò)增擴(kuò)增的起始部分，能限定待擴(kuò)增DNADNA序列的長(zhǎng)度。序列的長(zhǎng)度。 為了保證擴(kuò)增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應(yīng)為了保證擴(kuò)增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有至少有151518 bp18 bp。5 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物* * 如何設(shè)計(jì)如何設(shè)計(jì)PCRPCR引物引物要素之一要素之一（A A）引物來源：）引物來源： （1) 1) 購(gòu)買成套檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)單省力、購(gòu)買成套檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)單省力、 易出錯(cuò)、成本高易出錯(cuò)、成本高 （2) 2) 自

23、己合成自己合成 1 1）查文獻(xiàn)、查序列庫(kù)（計(jì)算機(jī)）查文獻(xiàn)、查序列庫(kù)（計(jì)算機(jī)） 直接查引物序列直接查引物序列合成；合成； 查靶序列自己設(shè)計(jì)查靶序列自己設(shè)計(jì) 2 2）依）依PCRPCR目的，選定靶序列上的兩側(cè)翼序列如目的，選定靶序列上的兩側(cè)翼序列如 作檢測(cè)，靶序列應(yīng)保守、特異（種、屬、作檢測(cè)，靶序列應(yīng)保守、特異（種、屬、 型特異）型特異） 3 3）必須有兩條不同引物，擴(kuò)增兩條不同鏈，）必須有兩條不同引物，擴(kuò)增兩條不同鏈，序列分析資料只能提供一個(gè)序列分析資料只能提供一個(gè)DNADNA鏈順序。假定鏈順序。假定是信息鏈的資料。是信息鏈的資料。 5 P2 33 P1 5l 信息鏈信息鏈5 35 3， 已知該

24、條信息鏈序列已知該條信息鏈序列/ /靶序列資料：靶序列資料：5 - T A T A A C5 - T A T A A C A T G A T G A A G A C G A G C A A G A C G A G C CACCAC/ CAG CGG CAG CGG/ CAC CGA CTC CAT CAC CGA CTC CAT TAATAACGTACG -3CGTACG -3必須據(jù)此序列置設(shè)兩個(gè)引物：必須據(jù)此序列置設(shè)兩個(gè)引物： 擴(kuò)增信息鏈的引物擴(kuò)增信息鏈的引物 擴(kuò)增其互補(bǔ)鏈的引物擴(kuò)增其互補(bǔ)鏈的引物 ( ( 知道知道DNADNA一條鏈序列，可依鹼基互補(bǔ)一條鏈序列，可依鹼基互補(bǔ)配對(duì)原則寫出另一互

25、補(bǔ)鏈序列配對(duì)原則寫出另一互補(bǔ)鏈序列 ） （4 4）誰(shuí)的引物合成誰(shuí)的鏈，但必須以對(duì)）誰(shuí)的引物合成誰(shuí)的鏈，但必須以對(duì)方鏈為模板，產(chǎn)物中的兩條新鏈，一條是信方鏈為模板，產(chǎn)物中的兩條新鏈，一條是信息鏈，另一條為與互補(bǔ)的非信息鏈。息鏈，另一條為與互補(bǔ)的非信息鏈。 （5 5）信息鏈引物的設(shè)計(jì)：）信息鏈引物的設(shè)計(jì)： 按信息鏈順序，在按信息鏈順序，在55分端選定部位，按分端選定部位，按堿基排列順序照抄堿基排列順序照抄10 - 2010 - 20個(gè)堿基，即信息個(gè)堿基，即信息鏈引物。合成新的信息鏈。鏈引物。合成新的信息鏈。 信息鏈引物：信息鏈引物： P1 P1 5ATGAAGACGAGCCAC5ATGAAGACG

26、AGCCAC（5 35 3）見圖）見圖 （6 6）非信息鏈引物的設(shè)計(jì)）非信息鏈引物的設(shè)計(jì) 在信息鏈的在信息鏈的 33端，選端，選10 - 2010 - 20堿基，寫出其互堿基，寫出其互補(bǔ)堿基，即為非信息鏈引物，將來以互補(bǔ)鏈為模補(bǔ)堿基，即為非信息鏈引物，將來以互補(bǔ)鏈為模板合成出新的非信息鏈，考慮到方向性。（板合成出新的非信息鏈，考慮到方向性。（5 5 33）l 非信息鏈引物：非信息鏈引物： P P2 2 5 5TTAATGGAGTCGGTGTTAATGGAGTCGGTG33 即按即按5 35 3寫出，（表面上與信息鏈順序反向）寫出，（表面上與信息鏈順序反向） 33 5P25P255TATAACT

27、ATAACATGAAGACGAGCCAC/ATGAAGACGAGCCAC/CACCGACTCCAGTTAACACCGACTCCAGTTAA3333ATATTGATATTGTACTTCTGCTCGGTGTACTTCTGCTCGGTG/GTGGCTGAGGTAATTGTGGCTGAGGTAATT55 P1 5 3 P1 5 3 P1 P1 5ATGAAGACGAGCCAC 3 5ATGAAGACGAGCCAC 3 （5 35 3） P2 P2 5TTAATGGAGTCGGTG 3 5TTAATGGAGTCGGTG 3 （5 35 3）（7 7）利用生物信息學(xué)）利用生物信息學(xué) 計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)分析計(jì)算機(jī)網(wǎng)

28、絡(luò)分析 DNAsis DNAsis 軟件。軟件。 （配對(duì)情況及設(shè)計(jì)合理性）（配對(duì)情況及設(shè)計(jì)合理性）（8 8）合成與純化）合成與純化（B B）設(shè)計(jì)引物十大原則）設(shè)計(jì)引物十大原則l 引物的設(shè)計(jì)在引物的設(shè)計(jì)在PCRPCR中很重要。（三定作用）中很重要。（三定作用）l 總體考慮：總體考慮： 特異性、高效擴(kuò)增特異性、高效擴(kuò)增和和自由度自由度廣泛應(yīng)用廣泛應(yīng)用 長(zhǎng)度長(zhǎng)度：15 - 35 15 - 35 堿基堿基( mer( mer，nt )nt ) 最好最好20 - 25 nt 20 - 25 nt 。 過短：特異性降低，結(jié)合不牢過短：特異性降低，結(jié)合不牢 過長(zhǎng)：成本高，特異性反而降低過長(zhǎng)：成本高，特異性反

29、而降低 （不易結(jié)合）（不易結(jié)合） 堿基組成：堿基組成： 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)，G+CG+C含量含量50%50%或或與目的片段相當(dāng)。與目的片段相當(dāng)。 G+CG+C太少擴(kuò)增效果不佳，太少擴(kuò)增效果不佳，G+CG+C過過多易出現(xiàn)非特異條帶。不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存多易出現(xiàn)非特異條帶。不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。在。尤其尤其33端不應(yīng)超過端不應(yīng)超過3 3個(gè)連續(xù)的個(gè)連續(xù)的G G或或C C，因這樣會(huì)，因這樣會(huì)使引物在使引物在G+CG+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。 引物內(nèi)部不應(yīng)有二級(jí)結(jié)構(gòu)，避開產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)引物內(nèi)部不應(yīng)有二級(jí)結(jié)構(gòu)，避開產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。影

30、響配對(duì)。區(qū)。影響配對(duì)。 引物之間特別是引物的兩端之間不能有互補(bǔ)的序引物之間特別是引物的兩端之間不能有互補(bǔ)的序列，減少引物形成列，減少引物形成“模板模板”，導(dǎo)致二聚體出現(xiàn)。一，導(dǎo)致二聚體出現(xiàn)。一對(duì)引物間對(duì)引物間不應(yīng)多于不應(yīng)多于4 4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 引物引物33端端 必須確保嚴(yán)格與目的片段互補(bǔ)，不能必須確保嚴(yán)格與目的片段互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，不能發(fā)生錯(cuò)配。進(jìn)行任何修飾，不能發(fā)生錯(cuò)配。 特別是最末及倒特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致基不配對(duì)而導(dǎo)致PCRPCR失敗失敗 33端未

31、位堿其端未位堿其少選少選A A。 以以T.C.GT.C.G為好。減少錯(cuò)配，避免引物不能延伸。為好。減少錯(cuò)配，避免引物不能延伸。另外另外33端最好選保守的三個(gè)堿基序列（如保守的端最好選保守的三個(gè)堿基序列（如保守的aaaa密碼）密碼） 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%70%或有或有連續(xù)連續(xù)8 8個(gè)互補(bǔ)堿基同源個(gè)互補(bǔ)堿基同源。 擴(kuò)增目的片段的長(zhǎng)度。擴(kuò)增目的片段的長(zhǎng)度。 引物擴(kuò)增跨度：引物擴(kuò)增跨度： 以以200-500bp200-500bp最好，最好，1kb1kb以以 下為宜。下為宜。3kb3kb3kb3kb效率大大下去降效率大大下去降, ,也能也能 擴(kuò)增

32、擴(kuò)增10kb10kb以上（困難）以上（困難） 所用引物濃度所用引物濃度 引物純度最好達(dá)引物純度最好達(dá)PAGEPAGE電泳純、電泳純、HPLCHPLC純。純。 引物濃度引物濃度0.1 - 0.5 - 1mol/L0.1 - 0.5 - 1mol/L或或1010 100pmol100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果 為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性 擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì) 兩引物濃度為兩引物濃度為1:11:1引物引物55端具包容性端具包容性，可容忍不配對(duì)序列存在，可

33、容忍不配對(duì)序列存在，據(jù)此可按需設(shè)計(jì)附加序列。據(jù)此可按需設(shè)計(jì)附加序列。 此附加序列配對(duì)時(shí)開始此附加序列配對(duì)時(shí)開始55端游離，以后因端游離，以后因已進(jìn)入產(chǎn)物序列，便可擴(kuò)增，如插入酶切位點(diǎn)，已進(jìn)入產(chǎn)物序列，便可擴(kuò)增，如插入酶切位點(diǎn)，調(diào)控元件，等調(diào)控元件，等。 密碼子的簡(jiǎn)并密碼子的簡(jiǎn)并 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物33端端不要終止于密碼子的第不要終止于密碼子的第3 3位，因密碼子的第位，因密碼子的第3 3位位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。l 綜上所述我們可以歸納綜上所述我們可以歸納十條十條PCRPCR引物的設(shè)計(jì)原則引物的設(shè)計(jì)原則： 引物應(yīng)用核酸系列

34、保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 引物長(zhǎng)度一般在引物長(zhǎng)度一般在15-3015-30堿基之間。堿基之間。 G+C G+C含量在含量在40%-60%40%-60%之間。之間。 堿基要隨機(jī)分布。堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)引物自身不能有連續(xù)4 4個(gè)堿基的互補(bǔ)。個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)引物之間不能有連續(xù)4 4個(gè)堿基的互補(bǔ)。個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物引物55端可以修飾。端可以修飾。 引物引物33端不可修飾。端不可修飾。 引物引物33端要避開密碼子的第端要避開密碼子的第3 3位。位。 * 酶及其濃度酶及其濃度要素

35、之二：要素之二： DNADNA聚合酶聚合酶 酶是酶是PCRPCR成功與否的另一關(guān)鍵因素成功與否的另一關(guān)鍵因素( (詳見后進(jìn)展詳見后進(jìn)展一節(jié)一節(jié)).).它決定了：它決定了： 酶促反應(yīng)能否進(jìn)行；酶促反應(yīng)能否進(jìn)行； 特異性催化特異性催化( (反應(yīng)、校對(duì)反應(yīng)、校對(duì)) )； 效率效率 ； 速度速度l常用的常用的TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶從棲熱水生桿菌中提純的天然酶。從棲熱水生桿菌中提純的天然酶。l催化一典型的催化一典型的PCRPCR反應(yīng)約需酶量反應(yīng)約需酶量2.5U2.5U（指總反應(yīng)體積為（指總反應(yīng)體積為100ul100ul時(shí)）時(shí)）l濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少過低則合成產(chǎn)物量減少* * dNTPdNTP質(zhì)量與濃度質(zhì)量與濃度要素之三要素之三l dNTP的質(zhì)量與濃度和的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系