核酸的分離純化

1、 前言前言1 1 核酸分離、純化原則核酸分離、純化原則1.1 1.1 保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性1.2. 1.2. 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解2 2 分離提取核酸的主要步驟分離提取核酸的主要步驟2.1 2.1 細胞的破碎細胞的破碎2.2 2.2 核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核蛋白的解聚、變性蛋白的去除2.3 2.3 核酸的沉淀核酸的沉淀2.4 2.4 核酸的濃度測定核酸的濃度測定2.5 2.5 核酸的保存核酸的保存 核酸核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。 無論是進行核酸結(jié)構(gòu)

2、還是功能研究，首先無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。需要對核酸進行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。前前 言言Home1.1 1.1 保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性1.1.1 1.1.1 意義：意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的核酸的級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。和其他生物大分子結(jié)合的方式。1.1.2 1.1.2 分離核酸原則：分離核酸原則： 1 1）溫度）溫度不要過高；不要過高； 2

3、2）控制控制pHpH值值范圍范圍(pH(pH值值5-9); 5-9); 3 3）保持一定保持一定離子強度離子強度; ; 4 4）減少物理因素對核酸的減少物理因素對核酸的機械剪切力機械剪切力. .Home 細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。 所用器械和一些試劑需高溫所用器械和一些試劑需高溫滅菌滅菌，提取緩，提取緩沖液中需加沖液中需加核酸酶抑制劑核酸酶抑制劑。(1(1） 金屬離子螯合劑：金屬離子螯合劑： DNADNA酶需要金屬二價離子酶需要金屬二價離子MgMg2+2+、CaCa2+2+的激活，

4、因的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNADNA酶活性。酶活性。如如EDTA-NaEDTA-Na2 2( (乙二胺四乙酸二鈉乙二胺四乙酸二鈉) )、8-8-羥基喹啉；羥基喹啉；(2(2） 陰離于型表面活性劑：陰離于型表面活性劑： 如如SDSSDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。 RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不

5、宜失活。且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 (1) 皂土（皂土（bentonite ） 作用機制：作用機制：皂土帶負電荷，能皂土帶負電荷，能吸附吸附RNase，使其失活。使其失活。 (2) DEPC(二乙基焦碳酸鹽二乙基焦碳酸鹽) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。 作用機制：作用機制：與蛋白質(zhì)中與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。結(jié)合使蛋白變性。 使用注意：使用注意： 1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大1001000倍。倍。 2）容易降

6、解，保存在）容易降解，保存在4 或液氮中；或液氮中； 3）提）提RNA時，時，0.1% DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h。 4）劇毒）劇毒。（3) 3) 肝素肝素（4 4）復合硅酸鹽（）復合硅酸鹽（MacaloidMacaloid) )（5 5）RNaseRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasinRNasin）（6 6）氧釩核糖核苷復合物）氧釩核糖核苷復合物 (Vanadyl-(Vanadyl-RibonucleosideRibonucleoside Complex, VRC) Complex, VRC)Home (1) (1) 高速組織搗碎機搗碎高速組織搗碎機搗碎 (2) (2) 玻璃勻

7、漿器勻漿玻璃勻漿器勻漿 (3) (3) 超聲波處理法超聲波處理法 (4) (4) 液氮研磨法液氮研磨法 (5) (5) 化學處理法化學處理法(SDS(SDS、LDSLDS，吐溫，吐溫8080等）等） (6) (6) 生化法（溶菌酶、纖維素酶等）生化法（溶菌酶、纖維素酶等）Home2.1 細胞的破碎細胞的破碎 2.2 2.2 核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電吸力吸力( (核酸與堿性蛋白的結(jié)合核酸與堿性蛋白的結(jié)合) )、氫鍵和非、氫鍵和非極性的范德華力。極性的范德華力。 分離核酸分離核酸最困難最困難的是將

8、與核酸緊密結(jié)合的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。 2.2.1 加入濃鹽溶液（如加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸核酸-蛋白質(zhì)加入蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；使氫鍵破壞，核蛋白解聚； 2.2.2 加入加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能； 2. 2.3 酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。并對核酸酶有抑制

9、作用。 氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。素和蔗糖的作用。 在酚在酚/ /氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為為防止起泡和促使水相與有機相的分離防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一，再加上一定量的異戊醇（定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉酚：氯：異戊醉=25=25：2424：1 1）。 (1(1）使用注意）使用注意 酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧

10、化產(chǎn)物，例如紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。 (2(2）安全操作）安全操作 酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。應戴手套。使用酚時應注意使用酚時應注意Home 沉淀是濃縮核酸最常用的方法。沉淀是濃縮核酸最常用的方法。 優(yōu)點優(yōu)點： 改變核酸的溶解緩沖液；改變核酸的溶解緩沖液； 重新調(diào)整核酸的濃度；重新調(diào)整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。鹽鹽貯存液濃

11、度（貯存液濃度（mol/L)終濃度終濃度(mol/L)MgCl210.01NaAc3 (pH5.2)0.3KAc3 (pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8 當核酸溶液的當核酸溶液的pHpH值大于值大于4 4時，核酸分子呈多聚陰離子時，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)，它與狀態(tài)，它與1 1價或價或2 2價陽離子形成的鹽在許多有機溶劑中價陽離子形成的鹽在許多有機溶劑中不溶解，也不會被有機溶課劑變性。不溶解，也不會被有機溶課劑變性。 （1 1）乙醇）乙醇優(yōu)點：優(yōu)點： 對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。揮發(fā)除去，不影

12、響以后實驗。缺點：缺點： 需要量大，一般要求低溫操作。需要量大，一般要求低溫操作。（2）異丙醇）異丙醇優(yōu)點：優(yōu)點： 需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNADNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點缺點： 易使鹽類、蔗糖與易使鹽類、蔗糖與DNADNA共沉淀異丙醇難以揮共沉淀異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用發(fā)除去。所以，最后用7070乙醇漂洗數(shù)次。乙醇漂洗數(shù)次。（3）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點：優(yōu)點： 可用不同濃度的可用不同濃度的PEGPEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的的DNADNA片段。

13、應用片段。應用60006000相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量的的PEGPEG進行進行DNADNA沉淀時，使用濃度與沉淀時，使用濃度與DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意： PEGPEG沉淀一般需加沉淀一般需加0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10 mmol10 mmol/L/L的的MgClMgCl2 2。要除去。要除去DNADNA沉淀中沉淀中PEGPEG。 精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNADNA。 原理是：原理是： 精胺與精胺與DNADNA結(jié)合后，使結(jié)合后，使DNADNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并

14、可使單核苷酸和蛋白質(zhì)縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與雜質(zhì)與DNADNA分開，達到純化分開，達到純化DNADNA的目的。的目的。 一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNADNA共沉淀，共沉淀，影響以后的實驗。一般使用影響以后的實驗。一般使用00冰水，冰水，10-10-15min15min， DNADNA樣品足可達到實驗要求。樣品足可達到實驗要求。Home 2.4.1 2.4.1 紫外分光光度法測紫外分光光度法測DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、

15、酚、核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應大于測定濃度應大于0.25 g/ml 。 結(jié)論：結(jié)論：在波長在波長260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度值的吸光度相當于雙鏈相當于雙鏈DNADNA濃度為濃度為50g/ml50g/ml；單鏈；單鏈DNADNA為為37 37 gg/ml/ml；RNARNA為為40 ug40 ug/ml/ml。a a吸取一定量的吸取一定量的DNADNA樣品或樣品或RNARNA樣品，加水至特定體積后，樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。b b分光光度計

16、先用一定量的水分光光度計先用一定量的水校正零點校正零點。c c測定待測樣品在測定待測樣品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值。值。d d計算濃度。計算濃度。 雙鏈雙鏈DNADNA樣品濃度樣品濃度(g/l(g/l) = OD) = OD260260核酸稀釋倍數(shù)核酸稀釋倍數(shù) 50/100050/1000； RNARNA樣品濃度樣品濃度(g/l(g/l) = OD) = OD260260核酸稀釋核酸稀釋倍數(shù)倍數(shù)40/100040/1000。e e分析純度。分析純度。A：測：測DNA： 純的純的DNA樣品樣品OD260/OD280應為應為1.8，OD260

17、mOD230應大于應大于2.0。1) OD260/OD280大于大于1.9時，表明有時，表明有RNA污染。污染。2) 小于小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；3) OD260/OD230小于小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：注： 可能可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的的DNA溶液比值為溶液比值為1.8的情況。的情況。 測定結(jié)果分析測定結(jié)果分析B B：測：測RNARNA 純的純的RNARNA樣品其樣品其OD260OD260OD280OD2

18、80應介于應介于1.7-2.01.7-2.0之之間，間，OD260/OD230OD260/OD230比值應大于比值應大于2.02.0。1 1）若）若RNARNA樣品樣品OD260/OD280OD260/OD280比值太小，說明有蛋比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染；白質(zhì)或酚的污染；2 2）比值大于）比值大于2.02.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；時，可能被異硫氰酸胍等污染；3 3）OD260/OD230OD260/OD230比值小于比值小于2.02.0時表明有小分子及時表明有小分子及鹽存在。鹽存在。 原理：原理：DNADNA、RNARNA在熒光染料溴乙錠在熒光染料溴乙錠(EB)(EB)嵌入堿基嵌入堿基平面之間后，平面之間后，DNADNA、RNARNA樣品在紫外光激發(fā)下，可樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使發(fā)出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度用一系列已知的不同濃度DNADNA溶液作標準對照，溶液作標準對照，可比較出被測可比較出被測DNADNA溶液濃度。溶液濃度。 注意：注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。此法的比較主要基于目測，是估計水平。Home(1) (1) 對對DNADNA DNADNA樣品溶于樣品溶于pH8.0pH8.0的的TETE