多糖分離純化

1、柱層析在多糖分子量分布測定的應(yīng)用方案細(xì)節(jié)組員：葉紹鋒、周靖波、黃皓暉、梁三威、丘式浚指導(dǎo)老師：廖勁松 柱層析技術(shù)(chromatography) (chromatography) 柱層析技術(shù)(chromatography) 又稱柱色譜技術(shù)，主要原理是根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復(fù)分配將組分分離開來。柱層析測定多糖分子分布量原理 多糖為單糖的天然聚合物, 多糖的性質(zhì)和藥理作用與其分子量大小, 分子量分布及其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。多糖的分子量不是均一的, 具多分散性, 需要用統(tǒng)計(jì)方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝膠色譜法測定多糖的分子量及其分布, 具有快速, 重現(xiàn)

2、性好等優(yōu)點(diǎn),在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用案例分析：多花黃精多糖云芝多糖蟲草多糖高效凝膠色譜法測定多花黃精多糖分子量與分子量分布 多花黃精多糖為水溶性多糖, 針對其單糖組成和空間結(jié)構(gòu)與葡聚糖相似, 在色譜柱的選擇上傾向于更適合于水溶性多糖分離測定用的Shodex OH Pak SB-803H Q 系列(對葡聚糖的排阻極限為1 105)操作流程1.色譜條件 色譜柱為Sho dex OH Pak SB-803HQ , 流動(dòng)相為0.71 %硫酸鈉溶液(內(nèi)含0.02 %疊氮鈉), 柱溫:35 , 示差折光檢測器(檢測器溫度35 ), 流速0.5 ml min -1 , 取供試品溶液及對照品溶液各20l 注入

3、液相色譜儀。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及樣品測定 取數(shù)個(gè)已知分子量的葡聚糖對照品，制成每1ml 中各含10 mg 的溶液作為對照品溶液，分別進(jìn)樣，由GPC 專用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 根據(jù)GPC 專用軟件繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及供試品的保留時(shí)間采用GPC 專用軟件計(jì)算樣品各組分的重均分子量及其分子量分布。 供試品溶液配置：多花黃精多糖適量, 加流動(dòng)相制成每1 ml 中約含10 mg 的溶液, 振搖, 室溫放置過夜操作流程3.精密度試驗(yàn) 取同一供試品連續(xù)測定5次，表明該系統(tǒng)測定樣品分子量的精密度良好。4.重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品制作5份供試品分別測定，表明該分析方法測定樣品分子量精密度良好。3.精密度試驗(yàn)取同一供

4、試品連續(xù)測定5次，表明該系統(tǒng)測定樣品分子量的精密度良好。操作流程5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品，在配置完成后不同時(shí)間段進(jìn)樣（0h 、2h 、4h 、8h 、12h.），表明供試品在配置后一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。6.樣品測定 取不同批號的多花黃精多糖樣品，制備供試品溶液，并進(jìn)行分子量及分子量分布的測定。高效凝膠色譜法測定云芝多糖的分子量及其分布 云芝多糖能激活人體內(nèi)巨噬細(xì)胞，從而具有增強(qiáng)人體免疫功能的作用，臨床上用于治療慢性乙型肝炎、免疫功能低下等疾病。1. 云芝多糖的純化 取云芝多糖原料約5 g，加水25 ml，微熱振搖使溶餌，用Sevage法去蛋白，即加入等量氯仿一正丁醇(4：1)充分振搖，離心，棄下

5、層凝膠樣物，取上層溶液同法處理，直至下層溶液不再出現(xiàn)凝膠樣物質(zhì)。取上層溶液加入4倍體積的無水乙醇，振搖，離心，棄溶液，取沉淀物，加水10 ml振搖使溶解，再加入4倍體積的無水乙醇，振搖，離心，同法處理兩次。取沉淀60C減壓干燥4 h，取干燥物研細(xì)，備用。操作流程2. 色譜條件 色譜柱：TSKGEL G3000PWxl，TSKGEL Gurad PWxl；流動(dòng)相：005 molL Na2SOd (含005 NaN。)，流速：06 mlmin；檢測器衰減：14，檢測器溫度25C(由RM6超級恒溫水浴循環(huán)水控制)；數(shù)據(jù)采集時(shí)間：22 min。操作流程3. 測定方法 取純化后的樣品以流動(dòng)相制成10 m

6、gml溶液，取右旋糖苷分子量對照品以流動(dòng)相制成5 mgml溶液，分別用05 gm微孔濾膜過濾，各取20 l注入色譜儀。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線 取重均分子量分別為200000、133800、84400、41100、21400、10000、4600和2500 Da的右旋糖苷分子量對照品溶液進(jìn)樣測定，記錄峰值保留時(shí)間，標(biāo)定色譜柱。以保留時(shí)間對分子量的對數(shù)作線性回歸，得回歸方程。操作流程蟲草多糖的柱層析分離純化 蟲草多糖為白色粉末，無異味，易溶于水，蟲草多糖是蟲草體內(nèi)含量最豐富、最重要的生物活性物質(zhì)之一，具有諸多藥理作用。一、蟲草多糖的柱層析分離純化操作流程操作流程二、分部收集及多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法

7、測定每管收集洗脫液的吸光值，繪制蟲草多糖各柱層析過程的蟲草多糖洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線合并每個(gè)波峰相應(yīng)波寬長度的洗脫管數(shù)，定容后測定多糖含量。操作流程三. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品系列分別用流動(dòng)相配成濃度為1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣品液，進(jìn)樣量為20ul，采集色譜圖，繪制曲線相關(guān)度較好的葡聚糖GPC校正曲線方程。 色譜條件：TSK-GEL G-5000 PW xl column（7.8mm 300mm）與TSK-GEL G-3000 PW xl column（7.8mm 300mm）串聯(lián)；流動(dòng)相0.02mol/L KH2PO4溶液，Ph6.0；流速0.6ml/min，柱溫35，進(jìn)樣量20l操作流程四.分子量測定 收集各多糖組分，經(jīng)濃縮，透析，真空干燥后，用流動(dòng)相配成濃度為1.0mg/ml的樣液，高速離心（10000r/min，10min）后，取1.0ml上清液，過0.