大腸桿菌的檢測(cè)(MPN計(jì)數(shù)法)

1、食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)課程綜述大腸桿菌的檢測(cè)（MPN計(jì)數(shù)法）院系： 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 班級(jí)： 食科114 姓名： 張花 學(xué)號(hào)： 114031431 組長(zhǎng)： 張軍玲 成員： 張花 趙晶郁 朱娟娟 大腸桿菌Petrifilm測(cè)試片計(jì)數(shù)法摘要 食品檢測(cè)是反映食品加工、貯藏、運(yùn)輸、等環(huán)節(jié)的衛(wèi)生與安全狀況的重要手段，而大腸菌群檢測(cè)則是食品檢測(cè)的重要指標(biāo)均之一。根據(jù)定義大腸菌群是在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和堿性厭氧的革蘭氏陰性芽胞桿菌。其主要檢測(cè)意義在于反映食品衛(wèi)生狀況并推測(cè)其在腸道致病菌的可能性。Petrifilm大腸菌群測(cè)試片是由美國(guó)3M生產(chǎn)的一種預(yù)先制備好的VRB平板培養(yǎng)基系統(tǒng)，并添加

2、了TTC作為菌落指示劑便于菌落判讀，而上層薄膜可以起到對(duì)大腸菌群發(fā)酵產(chǎn)生的氣體截留的作用。該方法目前已被多數(shù)權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可，并在國(guó)內(nèi)很多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展運(yùn)用。關(guān)鍵詞 大腸桿菌 Petrifilm測(cè)試法1設(shè)備和材料1.1恒溫培養(yǎng)箱：36±1。 1.2冰箱25。 1.3恒溫水浴箱 :44.5±0.2。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均質(zhì)器1.6振蕩器。 1.7無(wú)菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。1.8無(wú)菌錐形瓶：容量500mL。1.9 玻璃珠:直徑約5mm。 1.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙1.11試管架。 2. 培養(yǎng)基

3、和試劑2.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（ LST ）肉湯。2.2EC肉湯。2.3蛋白胨水。2.4緩沖葡萄糖蛋白胨水（MP-VP實(shí)驗(yàn)用）。2.5磷酸鹽緩沖液。2.6無(wú)菌生理鹽水:稱取8.5g氯化鈉溶于1000ml蒸餾水中，121高壓滅菌15min。2.71mol/L氫氧化鈉（NaOH ) ：稱取40g 氫氧化鈉溶于1000ml蒸餾水中。2.81mol/L 鹽酸（HCI ) ：移取濃鹽酸90ml，用蒸餾水稀釋至1000ml。3檢驗(yàn)程序4.樣品稀釋4.1固體和半固體樣品：以無(wú)菌操作將檢樣25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)或其他稀釋液的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠,經(jīng)充分振搖

4、或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器,以8 000-10 000 r/min的速度處理12min,做成1:10的樣品均勻稀釋液）。4.2液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取樣品25ml置盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）中，充分振搖，制成1：10的樣品勻液。4.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時(shí)分別用1mol/L氫氧化鈉（NaOH )或1mol/L 鹽酸（HCI )調(diào)節(jié)。4.4用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,沿管壁緩緩注入含有9mL磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌試管內(nèi),振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。 4.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),按上條操

5、作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全程不得超過(guò)15min。5檢驗(yàn)5.1接種和培養(yǎng) 選取23個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。將測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，揭開(kāi)上層膜，用吸管吸取樣品勻液1ml垂直地價(jià)在測(cè)試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下，將壓板放置在上層膜中央處，輕輕地壓下，是樣品勻液覆蓋與圓形的培養(yǎng)膜表面，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。拿起壓板，靜置至少1min意識(shí)培養(yǎng)基凝固。將測(cè)試片的透明面朝上放于36的培養(yǎng)箱內(nèi)，地跌層數(shù)不超過(guò)20片，肉、家禽和水產(chǎn)品，培養(yǎng)時(shí)間為24±2h；其他食品培養(yǎng)時(shí)間

6、為48±2h。5.1判讀可肉眼觀察計(jì)數(shù)，或用菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡、Petrifilm自動(dòng)判讀儀計(jì)數(shù)。藍(lán)色有氣泡的菌落確認(rèn)為大腸桿菌，不論藍(lán)色的深淺，部分藍(lán)色的帶氣泡菌落也判定為大腸桿菌。圓形培養(yǎng)膜邊緣及邊緣以外的菌落不計(jì)數(shù)。當(dāng)測(cè)試片出現(xiàn)大量氣泡、不明顯的小菌落，培養(yǎng)區(qū)成藍(lán)色時(shí)，需要進(jìn)一步稀釋樣品勻液，重新檢驗(yàn)。6 大腸桿菌測(cè)試片技術(shù)的報(bào)告選擇菌落數(shù)在15150之間的稀釋度，兩張測(cè)試片菌落平均乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數(shù)，以CFU/g(CFU/ml)表示。如果所有稀釋度測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于15，計(jì)數(shù)最低稀釋度測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如果所有稀釋度測(cè)試片上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，以“小于1乘以最低稀釋倍數(shù)”報(bào)告；如果所有稀釋度的菌落數(shù)都大于150，計(jì)數(shù)最高稀釋度測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。技術(shù)菌落數(shù)大于150個(gè)的測(cè)試片，可計(jì)數(shù)一個(gè)或兩個(gè)具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個(gè)方格內(nèi)的菌落數(shù)