實(shí)驗(yàn)四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

1、實(shí)驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)四、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膌學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)SDS-PAGESDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。l掌握垂直板電泳的操作方法。掌握垂直板電泳的操作方法。l運(yùn)用運(yùn)用SDS-PAGESDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。 二、實(shí)驗(yàn)原理l帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，這種帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為現(xiàn)象稱為電泳電泳。l區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶

2、液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或支持介樣品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。質(zhì)中遷移。l支持介質(zhì)的作用支持介質(zhì)的作用：防止機(jī)械干擾和由于溫度變化以及：防止機(jī)械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對(duì)流。大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對(duì)流。聚丙烯酰胺凝膠的聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠的聚合反應(yīng)l單體單體：丙烯酰胺（：丙烯酰胺（Acr）l交聯(lián)劑交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）l催化劑催化劑：過(guò)硫酸胺：過(guò)硫酸胺l加速劑加速劑：四甲基乙二胺（：四甲基乙二胺（TEMED）l產(chǎn)物產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠lPAGEPAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為根據(jù)

3、其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)和和不連續(xù)不連續(xù)系統(tǒng)系統(tǒng)兩大類。兩大類。l連續(xù)電泳連續(xù)電泳體系中緩沖液體系中緩沖液pHpH值及凝膠濃度相同，帶電值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)電荷和分子篩效應(yīng)分離。分離。l不連續(xù)電泳不連續(xù)電泳系統(tǒng)中緩沖液離子成分、系統(tǒng)中緩沖液離子成分、pHpH、凝膠濃度、凝膠濃度及電位梯度具有不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不及電位梯度具有不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有，還具有濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)，所分，所分離條帶清晰度及分辨率較好。離條帶清晰度及分辨率較好。不連續(xù)聚

4、丙烯酰胺凝膠電泳不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳n凝膠層由濃度不同的兩層凝膠組成凝膠層由濃度不同的兩層凝膠組成：上層凝膠濃：上層凝膠濃度較低（度較低（3 3），為大孔徑的），為大孔徑的濃縮膠濃縮膠，凝膠對(duì)溶質(zhì)，凝膠對(duì)溶質(zhì)的泳動(dòng)無(wú)阻滯作用，溶質(zhì)在此層得到濃縮；下層的泳動(dòng)無(wú)阻滯作用，溶質(zhì)在此層得到濃縮；下層凝膠濃度較高（凝膠濃度較高（5-255-25），為小孔徑的），為小孔徑的分離膠分離膠，各個(gè)組分根據(jù)遷移率的差別分離。各個(gè)組分根據(jù)遷移率的差別分離。n當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的pIpI小于小于8-9.58-9.5時(shí)，一般電極緩沖液采用時(shí)，一般電極緩沖液采用pH8.3pH8.3的的TrisTris- -甘氨酸緩沖

5、液，濃縮膠為甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.8pH6.8的的Tris-HClTris-HCl緩沖液，分離膠為緩沖液，分離膠為pH8.8pH8.8的的Tris-HClTris-HCl緩沖緩沖液。液。n在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即即樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。分辨率高。8.38.38.96.7lSDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中

6、引進(jìn)進(jìn)SDSSDS（十二烷基磺酸鈉）。（十二烷基磺酸鈉）。lSDSSDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。SDS-SDS-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)合物的形狀近似于復(fù)合物的形狀近似于長(zhǎng)橢圓棒長(zhǎng)橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的，不同蛋白質(zhì)的SDSSDS復(fù)合物復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣，而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量成正的短軸長(zhǎng)度都一樣，而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量成正比變化。比變化。l當(dāng)當(dāng)SDSSDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越其原來(lái)的電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越其原來(lái)的電荷，使蛋白質(zhì)分子間的電荷差別降使蛋白質(zhì)分子間的電荷差別

7、降低乃至消除。低乃至消除。lSDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只是蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的函數(shù)原有電荷和形狀的影響，只是蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的函數(shù)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳l當(dāng)分子量在當(dāng)分子量在15KD15KD到到200KD200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：lgMW=K-lgMW=K-bXbX 式中：式中：MWMW為分子量，為分子量，X X為遷移率，為遷移率，k k、b b均為常數(shù)。均為常數(shù)。l

8、若將若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)對(duì)分子量對(duì)數(shù)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。求得分子量。 15% 15-45Kd 12.5% 15-60Kd 10% 18-75Kd 7.5% 30-120Kd 5% 60-210Kd 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺濃度越高，凝膠孔徑越小，適合濃度越高，凝膠孔徑越小，適合分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量越小。分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量越小。不同濃度聚丙烯酰胺分離膠分離蛋白質(zhì)

9、范圍不同濃度聚丙烯酰胺分離膠分離蛋白質(zhì)范圍l采用采用SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)蛋白質(zhì)分子量時(shí)，只有完全打聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)蛋白質(zhì)分子量時(shí)，只有完全打開二硫鍵，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，開二硫鍵，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDSSDS才能定量地結(jié)合到亞基才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。因此在用上而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。因此在用SDSSDS處處理樣品同時(shí)往往用理樣品同時(shí)往往用巰基乙醇巰基乙醇處理，使被還原的二硫鍵不易再氧化，處理，使被還原的二硫鍵不易再氧化，使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDSSDS定量結(jié)合。定量結(jié)合。l有

10、許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，在有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，在SDSSDS和巰基乙和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)只是醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)只是它們的它們的亞基或單條肽鏈的分子量亞基或單條肽鏈的分子量。l已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS-PAGESDS-PAGE測(cè)定分子量。如電荷異?；驕y(cè)定分子量。如電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。l一般至少采用兩種

11、方法測(cè)定未知樣品分子量，互相驗(yàn)證。一般至少采用兩種方法測(cè)定未知樣品分子量，互相驗(yàn)證。三.實(shí)驗(yàn)試劑和器材 1. 材料材料低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌動(dòng)蛋白兔肌動(dòng)蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 MW=14,400根據(jù)說(shuō)明書處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白。根據(jù)說(shuō)明書處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白。2.實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑（1）30%丙烯酰胺丙烯酰胺（Acr）：稱）：稱Acr29g，甲

12、叉雙丙烯酰胺（，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）1g， 加蒸餾水至加蒸餾水至100mL，過(guò)濾后置棕色瓶中，過(guò)濾后置棕色瓶中，4貯存可用貯存可用1-2月。月。（2）1.5mol/L Tris-HCl緩沖液，緩沖液，pH8.8 ：稱取：稱取Tris18.2g，加入，加入 50mL水，用水，用50鹽酸調(diào)鹽酸調(diào)pH8.8， 最后用蒸餾水定容至最后用蒸餾水定容至100mL。（3）1.0mol/L Tris-HCl緩沖液，緩沖液，pH6.8：稱取：稱取Tris12.1g，加入，加入50mL 水，用水，用50鹽酸調(diào)鹽酸調(diào)pH6.8， 最后用蒸餾水定容至最后用蒸餾水定容至100mL。（4）10%SDS（十二烷基磺酸鈉

13、）。（十二烷基磺酸鈉）。（5）10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨（AP）：稱取）：稱取0.1g過(guò)硫酸銨，加入過(guò)硫酸銨，加入1mL水溶解。水溶解。（6）TEMED（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（7）2SDS-PAGE上樣緩沖液上樣緩沖液： 0.4g SDS， 20mg溴酚藍(lán)，溴酚藍(lán)， 2mL甘甘 油，油，1mL 1M Tris-HCl（pH8.0），）， 20L 巰基乙醇，定容至巰基乙醇，定容至10mL。（8）SDS-PAGE電泳緩沖液電泳緩沖液（25mM Tris，0.25M甘氨酸，甘氨酸， 0.1%SDS， pH8.3）：稱）：稱Tris3.02g，甘，甘 氨酸氨酸18.8g，加入，加入SDS 1g，

14、加蒸餾水使其，加蒸餾水使其 溶解后定容至溶解后定容至1L。（9）染色液染色液：稱考馬斯亮藍(lán)：稱考馬斯亮藍(lán)R250 0.25g，溶于，溶于227mL蒸餾水，蒸餾水，227mL甲甲 醇，醇，46mL冰醋酸的混合液中，過(guò)濾后備用。冰醋酸的混合液中，過(guò)濾后備用。（10）脫色液脫色液：冰乙酸：冰乙酸100ml，乙醇，乙醇50ml，加蒸餾水，加蒸餾水850mL，混勻。，混勻。考馬斯亮藍(lán)染色法所用試劑考馬斯亮藍(lán)染色法所用試劑（11）銀染固定液。）銀染固定液。10%冰乙酸溶液。冰乙酸溶液。（12）銀染溶液。）銀染溶液。0.1%硝酸銀溶液硝酸銀溶液100 mL，使用前加，使用前加37%甲醛甲醛0.5 mL。（1

15、3）顯影液。）顯影液。3%碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液200 mL，使用前加硫代硫酸，使用前加硫代硫酸鈉鈉0.8 mg和和37%甲醛甲醛1 mL。銀染法所用試劑銀染法所用試劑3. 實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材l垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置l直流穩(wěn)壓電源直流穩(wěn)壓電源l移液管移液管l濾紙濾紙 l微量注射器微量注射器l大培養(yǎng)皿大培養(yǎng)皿四、實(shí)驗(yàn)要求四、實(shí)驗(yàn)要求l樣品樣品1：蔗糖酶：蔗糖酶l樣品樣品2：肌酸激酶（從中華鱉肌肉中提?。杭∷峒っ福◤闹腥A鱉肌肉中提?。﹍樣品樣品3：牛血清白蛋白牛血清白蛋白l樣品樣品4：酪氨酸酶（從雙胞蘑菇中提取）：酪氨酸酶（從雙胞蘑菇中提?。└鶕?jù)老師提供的蛋白質(zhì)樣品，先查閱資料，按根據(jù)老師提供

16、的蛋白質(zhì)樣品，先查閱資料，按其分子量選擇合適的凝膠濃度進(jìn)行其分子量選擇合適的凝膠濃度進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，選擇考馬斯亮藍(lán)或銀染法進(jìn)行染色，凝膠電泳，選擇考馬斯亮藍(lán)或銀染法進(jìn)行染色，測(cè)定樣品的分子量和純度情況。測(cè)定樣品的分子量和純度情況。五.實(shí)驗(yàn)步驟 1.配制配制SDS聚丙烯酰胺凝膠所需的各種試劑聚丙烯酰胺凝膠所需的各種試劑2.SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制聚丙烯酰胺凝膠的灌制 1）根據(jù)廠家說(shuō)明書安裝玻璃板）根據(jù)廠家說(shuō)明書安裝玻璃板 2）確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一）確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶小燒杯中按所需丙烯酰胺

17、濃度配制一定體積的分離膠溶液。一旦加入液。一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。l3）迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌）迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所需空間（梳子的齒長(zhǎng)再加注濃縮膠所需空間（梳子的齒長(zhǎng)再加0.5cm）。再在膠液）。再在膠液面上小心注入面上小心注入1mL蒸餾水以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。蒸餾水以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。l4）分離膠聚合完全后（約）分離膠聚合完全后（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。用濾紙吸凈殘留水。 水封的

18、目的是為了使分離膠上延平直，并隔絕空氣。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并隔絕空氣。 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。l 5）制備濃縮膠：按下表給出的數(shù)據(jù)，在另一小燒杯中）制備濃縮膠：按下表給出的數(shù)據(jù)，在另一小燒杯中 制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，一旦加入制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。下步操作。l6）聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中）聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干

19、凈的梳子。加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，插入干凈的梳子。加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。將凝膠垂直放置于室溫下。l7）在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行處理，在樣品中按）在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行處理，在樣品中按1:1體積比加入上樣緩沖液，在體積比加入上樣緩沖液，在100加熱加熱5分鐘以使蛋白質(zhì)分鐘以使蛋白質(zhì)變性。變性。l8）濃縮膠聚合完全后（）濃縮膠聚合完全后（30分鐘），小心移出梳子。把凝膠分鐘），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。甘氨酸電極緩沖液。要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，否

20、則會(huì)影響加樣效果。要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，否則會(huì)影響加樣效果。樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處 不得有氣泡，梳底需水平。不得有氣泡，梳底需水平。3.加樣電泳加樣電泳l1）按預(yù)定順序加樣，加樣量通常為）按預(yù)定順序加樣，加樣量通常為1025L（1.5mm厚的膠）。厚的膠）。l2）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為60V。當(dāng)染料前沿進(jìn)。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到入分離膠后，把電壓提高到120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約底部上方約1cm，然后關(guān)閉電源。，然后關(guān)閉電源。l3）從電泳裝

21、置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。（第一槽）凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。 槍頭插入不可過(guò)低，以防刺破膠體，也不可過(guò)高，在樣品下沉?xí)r會(huì)擴(kuò)散。槍頭插入不可過(guò)低，以防刺破膠體，也不可過(guò)高，在樣品下沉?xí)r會(huì)擴(kuò)散。 為避免邊緣效應(yīng)，最好選用中部的孔注樣。為避免邊緣效應(yīng)，最好選用中部的孔注樣。剝膠時(shí)要小心，保持膠完好無(wú)損。剝膠時(shí)要小心，保持膠完好無(wú)損。1）用考馬斯亮藍(lán)對(duì)）用考馬斯亮藍(lán)對(duì)SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色l經(jīng)經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬

22、斯聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍(lán)亮藍(lán)R250染色。染色染色。染色1小時(shí)。小時(shí)。2）換脫色液脫色）換脫色液脫色l需需310小時(shí)，其間更換多次脫色液至背景清楚。小時(shí)，其間更換多次脫色液至背景清楚。l脫色后，對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。脫色后，對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。4.染色方法染色方法考馬斯亮藍(lán)染色法考馬斯亮藍(lán)染色法 要求盡量在低溫下操作，所有溶液提前預(yù)冷到要求盡量在低溫下操作，所有溶液提前預(yù)冷到4，戴手套操作，以免指紋污染。戴手套操作，以免指紋污染。l1）把膠放入塑料盒中，加入銀染固定液約）把膠放入塑料盒中，加入銀染固定液約35倍的體積，倍的體積，沒(méi)過(guò)凝膠，在搖床上慢速振蕩沒(méi)過(guò)凝膠，在搖床上慢速振

23、蕩30min。l2）蒸餾水洗膠）蒸餾水洗膠3次，每次次，每次2min。l3）轉(zhuǎn)移凝膠到銀染溶液中，注意：）轉(zhuǎn)移凝膠到銀染溶液中，注意：37%甲醛甲醛0.5mL在使在使用前才能加入。搖床上慢速振蕩染色用前才能加入。搖床上慢速振蕩染色30 min。l4）轉(zhuǎn)移凝膠到）轉(zhuǎn)移凝膠到10以下的蒸餾水中振蕩洗滌以下的蒸餾水中振蕩洗滌10sec 。銀染法銀染法l5）快速轉(zhuǎn)移凝膠到顯影液中，注意：硫代硫酸鈉）快速轉(zhuǎn)移凝膠到顯影液中，注意：硫代硫酸鈉0.8 mg和和37%甲醛甲醛1mL在使用前才能加入。快速在使用前才能加入?？焖?振蕩并觀察斑振蕩并觀察斑帶的出現(xiàn)，若理想結(jié)果一出現(xiàn)應(yīng)及時(shí)終止顯影。如果顯影帶的出現(xiàn)，

24、若理想結(jié)果一出現(xiàn)應(yīng)及時(shí)終止顯影。如果顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，凝膠背景顏色變深，影響整體效果。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，凝膠背景顏色變深，影響整體效果。l6）終止顯影。把凝膠放回原來(lái)的銀染固定液中，中速振）終止顯影。把凝膠放回原來(lái)的銀染固定液中，中速振蕩蕩5min。l7）蒸餾水漂洗最后一次。凝膠成像系統(tǒng)掃描。）蒸餾水漂洗最后一次。凝膠成像系統(tǒng)掃描。六六. . 計(jì)算分析計(jì)算分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線： 按下式計(jì)算相對(duì)遷移率：按下式計(jì)算相對(duì)遷移率： 蛋白樣品距加樣端距離（蛋白樣品距加樣端距離（cm） 相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率 溴酚藍(lán)區(qū)帶距加樣端距離（溴酚藍(lán)區(qū)帶距加樣端距離（cm） 以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作

25、圖得以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量。標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量。 注意：這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上注意：這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)l丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大暴露量不超過(guò)暴露量不超過(guò)0.5g/kg，皮膚接觸可致中毒，皮膚接觸可致中毒，癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動(dòng)作機(jī)能失調(diào)、四癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動(dòng)作機(jī)能失調(diào)、四肢無(wú)力等。丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，可以透過(guò)皮肢無(wú)力等。丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，可以透過(guò)皮膚，不要接觸皮膚，戴手套、口罩操作。膚，不要接觸皮膚，戴手套、口罩操作。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)l沒(méi)有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近沒(méi)有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近l一定要催化充分，使之完全聚