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文檔簡介
1、復方水蛭膠囊防治動脈粥樣硬化單因素效應分析 作者:張潮林, 胡旭光, 宋增炫, 沈雪梅【關(guān)鍵詞】 黃芪腸寧顆粒;,提取工藝;,潰瘍性結(jié)腸炎;,藥效學摘要:目的探討復方黃芪腸寧顆粒的提取工藝。方法觀察不同提取工藝制得的提取物,對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠經(jīng)保留灌腸后體征變化及病理組織學變化。結(jié)果4種不同提取工藝的提取物都可改善模型小鼠的體征和病理組織學變
2、化;工藝3效果最顯著。結(jié)論 工藝3為較優(yōu)的提取工藝,即部分藥材先用70%乙醇提取,藥渣再與其余藥材共水煎煮的提取工藝。關(guān)鍵詞:黃芪腸寧顆粒; 提取工藝; 潰瘍性結(jié)腸炎; 藥效學Abstract:ObjectiveTo investigate the extract technology of compound HuangQi ChangNing granula.MethodsTo observe the physical signs and the pathological tissue change of ulcerative colitis mice g
3、iven compound HuangQi ChangNing granula by different extraction technologies. ResultsAll the different extract compounds could improve the physical signs and the pathological tissue changes; the effect of technology NO.3 was better than that in other groups.ConclusionTechnology NO.3 was selected as
4、the optimal extract technology. Key words:HuangQi ChangNing granula; Extract technology; Ulcerative colitis; Pharmacodynamics 復方黃芪腸寧湯的處方,是在中醫(yī)藥理論指導下,針對潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)的病因病機,由黃芪、補骨脂、仙鶴草等藥組成。該方具有益腎健脾、化濕清熱、通經(jīng)生肌的功效。臨床上將其制成煎煮液
5、,通過保留灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎,取得了良好療效。但因需臨時制備,臨床使用不方便,且藥液質(zhì)量難于控制。因此,作者擬將其研制成臨床上使用方便、質(zhì)量穩(wěn)定可控的顆粒劑。不同提取工藝制得的提取液中所含成分是不同的,因而會導致藥效的差異。本文采用小鼠實驗潰瘍性結(jié)腸炎模型,對復方黃芪腸寧方劑的4種不同提取工藝制得的提取物做藥理效應的比較,以確立復方黃芪腸寧顆粒的初步提取工藝,為進一步優(yōu)化該制劑的提取工藝奠定基礎(chǔ)。1 材料1.1 動物昆明種小鼠(體重1822 g ,雌雄各半,廣東省實驗動物中心,SCX粵20030002)。1.2 藥品 柳氮磺吡啶(SASP,上海三維制藥有限
6、公司,批號200510C21);醋酸(化學醇);藥材(廣州市致信藥業(yè),經(jīng)鑒定符合中國藥典2005年版標準)。2 方法2.1 模型的建立1,2小鼠禁食不禁水12 h,經(jīng)肛門向結(jié)腸內(nèi)注入5的醋酸溶液0.1 ml(小鼠肛門內(nèi)約3 cm),然后正常飼養(yǎng)1 d,即得。2.2 供試藥液的制備工藝1提取液:按處方比例稱取藥材,分別加入10,8倍量水,回流提取兩次,分別為1.5,1.0 h/次,合并藥液,過濾,濾液經(jīng)離心(30005000 r/min,10 min),取上清液,濃縮到每毫升相當于藥材4.8 g,即14.8,即得。 工藝2提取液:按處方比例稱取藥材,分別加入1
7、0倍量、8倍量水,回流提取2次,分別1.5,1.0 h/次。合并藥液,過濾,濾液濃縮至300 ml,加入乙醇調(diào)整含醇量達50,靜置24 h,減壓濾過,濾液回收乙醇,繼續(xù)濃縮到14.8,即得。工藝3提取液:按處方比例稱取黃芪、補骨脂等4味藥材,加入8倍量70乙醇回流提取1.5 h,過濾,濾液回收乙醇至無乙醇味,備用,得;藥渣與其余藥材加水共煎,分別加入10,8倍量水,煎煮1.5,1.0 h,過濾。合并濾液 ,濃縮至150 ml,加入乙醇調(diào)整含醇量至50,靜置24 h,減壓過濾,回收乙醇,濃縮,與醇提液混合,繼續(xù)濃縮到14.8,即得。工藝4提取液:按處方比例稱取黃芪等4味藥材,分別加入8,6倍量7
8、0乙醇,回流提取2次,1.5,1.0 h/次。藥液經(jīng)過濾,回收乙醇,濃縮至無乙醇味,得藥液;取仙鶴草等其余藥材,分別加入10,8倍量水,回流提取兩次,合并濾液,過濾,與混合,繼續(xù)濃縮至14.8,即得。 陽性對照藥液: 精密稱取SASP1.375 g,用0.5的羧甲基纖維素鈉水溶液研磨,定容至25 ml,混勻,即得。本品為每毫升含SASP0.055 g的混懸液。2.3 分組與給藥方法將造模小鼠隨機分為7組,包括工藝1,2,3,4組、陽性對照組、空白對照組、模型組。各組動物灌藥前禁食不禁水12h,按照人與動物等效劑量換算方法確定小鼠的給藥量。4個工藝組分別給予不同提取工藝制備的提取液,
9、每次給藥0.1ml(相當于生藥26.2g/);陽性對照組給予SASP的混懸液0.1ml(相當于0.27g/kg);空白對照組給予蒸餾水0.1ml;模型組造模后正常喂養(yǎng)。同時設(shè)立正常組。每組小鼠灌藥1次/d,連續(xù)3 d。給藥期間觀察各項體征指標,3 d后處死,觀察結(jié)腸病理指標。2.4 觀察指標22.4.1 體征指標 觀察小鼠的體重、活動、毛色、大便、進食等狀況,重點觀察是否腹瀉及膿血便等。正常大便指形成顆粒樣便;半稀便指糊狀或半成型不黏肛便;稀便指水樣黏肛便。 2.2.4 病理指標 灌藥結(jié)束后,拉頸處死小鼠,打開腹腔,分離大腸,沿腸系膜附著部縱行剪開腸壁,冰生
10、理鹽水沖洗干凈,平展在放大鏡下,觀察結(jié)腸形態(tài)改變。肉眼觀察 結(jié)腸黏膜出現(xiàn)的潰瘍點、糜爛點、紅腫、出血點; 病理切片觀察 自病變嚴重部位取結(jié)腸組織標本約0.70.8 cm,置10甲醛液中固定,常規(guī)石蠟包埋,切片(5m),HE染色,鏡下觀察結(jié)腸的潰瘍、炎癥細胞浸潤等病理學變化。2.5 統(tǒng)計學處理方法計數(shù)資料用卡方檢驗,計量資料用t檢驗。3 結(jié)果3.1 體征變化正常對照組,小鼠反應靈活,毛色光澤,喜活動,主動覓食、大便成小球狀。模型組,造模5 h后,即排出稀便,隨后逐漸加重,相繼排出黏液膿血便;進食減少、體重減輕、消瘦、倦怠懶動、喜扎堆、拱背、豎毛、毛色無光澤、無
11、毛發(fā)自凈習慣、精神萎靡。各給藥組,先出現(xiàn)模型組所述癥狀,但隨時間延長而有不同程度的改善,用藥1 d后大便狀態(tài)開始好轉(zhuǎn),進食量逐漸增加,體重增加明顯,活動增多,給藥3 d后毛色轉(zhuǎn)榮,黏液便停止。3.2 結(jié)腸變化給藥3 d后,處死小鼠,取結(jié)腸標本。模型組與空白對照組可見結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫、糜爛、出血灶,甚者可見大片黑褐色壞死組織,多個潰瘍及糜爛面。用藥各組上述癥狀明顯減輕,愈合的結(jié)腸表面呈淺粉紅色。記錄結(jié)腸未愈潰瘍的小鼠數(shù)以及潰瘍點數(shù)。結(jié)果見表1。表1 給藥后各組肉眼觀察結(jié)果(略)各給藥組與模型組、空白對照組比較,*P0.05;潰瘍未愈小鼠數(shù),各給藥組間比較,P0.05
12、;潰瘍點數(shù),工藝3組與其他工藝組比較,P0.05;與陽性對照組比較,P0.05;n113.3 病理切片 正常對照組小鼠結(jié)腸皺壁規(guī)整,血管紋理清晰,未見糜爛和潰瘍,黏膜上皮細胞排列整齊,腸線規(guī)則,杯狀細胞豐富,間質(zhì)未見水腫和充血。結(jié)果見圖1。模型組小鼠可見腸黏膜上皮灶性壞死,脫落,黏膜及黏膜下層血管高度擴張,充血及出血;黏膜下層可見大量炎癥細胞浸潤,部分腸管全層壞死。結(jié)果見圖2。圖1 正常對照組(略)
13、60; 圖2 模型組(略) 空白對照組可見潰瘍深達肌層,未見肉芽組織形成,潰瘍鄰近的腸黏膜上皮灶性壞死,脫落,黏膜及黏膜下層血管高度擴張,充血及出血;黏膜下層可見大量炎癥細胞浸潤,腸管全層壞死。結(jié)果見圖3。陽性對照組與4個工藝組可見結(jié)腸黏膜上皮完整,未見壞死、脫落,腺管排列整齊;潰瘍病灶已全部愈合或部分愈合,底部已有肉芽組織形成,上皮細胞增生并覆蓋肉芽組織表面。結(jié)腸黏膜基本形態(tài)與正常對照組相似。結(jié)果見圖45。圖3 空白對照組(略)
14、; 圖4 陽性對照組(略)圖5 工藝3組(略)4 討論4.1 本文采用醋酸刺激法制作小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,其機理是利用醋酸的化學刺激造成結(jié)腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)破壞,繼而產(chǎn)生炎癥。該模型制作的關(guān)鍵是醋酸濃度和灌注劑量,本實驗以5%醋酸(v/v),灌注0.1 ml。灌腸后小鼠表現(xiàn)為懶動、大便稀薄伴血性分泌物、體重減輕。1 d后處死小鼠,取出近肛門端3 cm左右的結(jié)腸,作病理組織學檢查,可見黏膜表面有彌散性出血點、紅斑和潰瘍,上皮糜爛、壞死,黏膜下水腫及潰瘍形成,可以確定造模成功。潰瘍、
15、糜爛點是潰瘍性結(jié)腸炎病人結(jié)腸鏡下的重要病理表現(xiàn),也是作為該病診斷及分期的依據(jù)之一3,該模型符合潰瘍性結(jié)腸炎的病理特征。上述病理癥狀1周后自愈。醋酸刺激法造成的急性潰瘍性結(jié)腸炎損傷模型,具有造模時間短、容易復制、結(jié)腸損傷(潰瘍、糜爛、淋巴細胞浸潤程度)明顯的特點,適合新藥的篩選研究。4.2 小鼠連續(xù)直腸灌藥3 d后,各給藥組小鼠的主要癥狀及體征變化均較模型組、空白對照組有明顯改善(P0.05),腹瀉、黏液便等癥狀減輕,體重增加明顯。各給藥組之間潰瘍未愈的小鼠動物數(shù)無顯著差異(P0.05)。結(jié)果提示,不同提取工藝所制得的復方黃芪腸寧提取物均具有明顯的對抗醋酸誘導的炎性病理損害作用,能緩解局部炎癥和改善機體狀態(tài),但工藝3所得提取物的療效更好:粘膜水腫、充血、潰瘍、糜爛癥狀明顯減輕;潰瘍點數(shù)最少,與其他工藝組存在顯著差異(P0.05),與SASP組無顯著差異(P0.05);結(jié)腸皺壁及粘膜上皮完整,結(jié)腸粘膜內(nèi)潰瘍基本愈合,并形成瘢痕;有較多杯狀細胞,黏膜下層只有少量炎癥細胞浸潤(淋巴細胞為主),其基本形態(tài)與正常組相似。4.3 中藥復方制劑以多種成分發(fā)揮綜合療效,其中的一種或幾種活性成分往往不能體現(xiàn)處方的藥效,故僅僅以活性成分為指標篩選提取工藝有一定局限性。因此,在確定復方中藥制劑的提取工藝時,可以先根據(jù)處方的藥效,通過藥理學實驗,初步篩選提取工藝,在此基
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