實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)

1、實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)前要說(shuō)明的幾點(diǎn)問(wèn)題點(diǎn)名, 查看學(xué)生出勤情況。總結(jié)上次作業(yè)，提出作業(yè)中出現(xiàn)的問(wèn)題并講解。二、板書(shū)部分（一）目的要求1. 掌握需氧菌分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)。2. 了解厭氧菌的分離培養(yǎng)原則及方法。（二）實(shí)驗(yàn)容1. 用普通瓊脂平板做一次劃線分離培養(yǎng)。2. 用普通肉湯做一管大腸桿菌的移植培養(yǎng)。3. 用普通瓊脂斜面做一管金黃葡萄球菌的移植培養(yǎng)。4. 用劃線法進(jìn)行真菌的分離培養(yǎng)（示教）（三）作業(yè)1. 為什么要進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)？2. 進(jìn)行分離培養(yǎng)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？3. 細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法有哪些？（重點(diǎn)敘述平板劃線法）4. 敘述真菌的劃線分離方法。三、實(shí)驗(yàn)容主要容有分離培養(yǎng)及目的

2、、注意事項(xiàng)、分離培養(yǎng)的方法、真菌的培養(yǎng)方法、 患病動(dòng)物病料中分離培養(yǎng)、釣菌、移植。1. 什么是分離培養(yǎng)及目的： 分離培養(yǎng)是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的基本技術(shù)之一。 分離培 養(yǎng)之目的，在于從被檢材料中由多種細(xì)菌里分離出一種細(xì)菌。2. 注意事項(xiàng)：1）分離培養(yǎng)前應(yīng)考慮所分離的細(xì)菌的特性，選擇適合其生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基 （需氧還是厭氧、營(yíng)養(yǎng)的要求高還是不高、培養(yǎng)溫度等）等。例如：鏈球菌在普 通瓊脂不長(zhǎng)，要加血清或血液。 大腸桿菌和葡萄球菌要求較低， 普通的培養(yǎng)基即 可生長(zhǎng)。2）防止污染。分離培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作。培養(yǎng)基和一切用具必須徹底滅菌；操作時(shí)必須靠近火焰； 操作完畢后，禁止再讓培養(yǎng)基接觸外界空氣。3）防止

3、接種器械過(guò)熱，很容易殺死分離培養(yǎng)的細(xì)菌，如接種環(huán)在燒灼滅菌 后，不能立即釣取細(xì)菌材料， 應(yīng)在酒精燈旁涼涼； 另外還應(yīng)注意防止已釣取菌料 的接種環(huán)，不慎通過(guò)火焰而將細(xì)菌殺死。4）初代分離時(shí)發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌，觀察找到目的菌落，再拿一肉湯培養(yǎng)基純 化培養(yǎng)。然后在接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，作成凝集抗原，做血清學(xué)鑒定， 。還可以反過(guò)來(lái) 做抹片染色觀察。3. 分離培養(yǎng)的方法：主要分需氧菌的分離培養(yǎng)方法、厭氧菌的分離培養(yǎng)方法和需要co菌的培養(yǎng)分離方法。1）需氧菌的分離培養(yǎng)法（1）平板劃線法：劃線后有單個(gè)菌落，便于觀察菌落的形態(tài)、溶血性等。 方法左手拿瓊脂平板，使其與水平面成 45。角；右手拿鉑金耳，使之與水平面平 行，靠

4、近酒精燈火焰操作。將接種環(huán)于酒精燈火焰中灼燒滅菌，待其冷卻后，蘸 取欲檢材料少許，注意不要?jiǎng)澠骗傊灰獎(jiǎng)澋锰?，以免造成浪費(fèi)，不要重復(fù) 劃線，以免形成菌苔。劃線方法：方格劃線、蛇形劃線、區(qū)域劃線、交叉劃線， 選擇其中一種進(jìn)行劃線。 劃畢，將接種環(huán)燒灼滅菌， 于皿底用蠟筆標(biāo)記被檢材料 名稱(chēng)及日期，倒轉(zhuǎn)置恒溫箱中培養(yǎng)。 思考題：方格劃線哪個(gè)地方會(huì)長(zhǎng)出單個(gè)菌落比較多？（2）傾注法：不常用，這里不做介紹2）厭氧菌的分離培養(yǎng)方法厭氧菌生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境不能有游離氧的存在。 故在培養(yǎng)厭氧菌時(shí)， 必須創(chuàng)造 一個(gè)厭氧環(huán)境， 一般以降低氧的力或保持減低的氧力為原則。 目前應(yīng)用于厭氧菌 的分離方法頗多，現(xiàn)就其中較簡(jiǎn)

5、便且常用的幾種方法介紹如下：（1）焦性沒(méi)食子酸法 利用焦性沒(méi)食子酸在堿性溶液能大量地吸收氧的原 理進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。通常100cm3空間用焦性沒(méi)食子酸1g, 10%氫氧化鈉或氫氧化鉀 10ml。具體方法有下列有平板培養(yǎng)法、 干燥器培養(yǎng)法。平板培養(yǎng)法是將厭氧菌劃 線接種于適宜的瓊脂平板，取一小團(tuán)直徑約2cm的脫脂棉，置于平皿蓋的面中央， 其上滴加10%氫氧化鈉溶液約 5ml;在靠近脫脂棉的一側(cè)放置焦性沒(méi)食子酸約0.5g, 注意暫勿使兩者接觸，立即將已接種好的平板覆蓋于平皿蓋上，迅速用融 化的石蠟密封平皿邊緣周?chē)?封畢， 輕輕搖動(dòng)平皿， 使被氫氧化鈉溶液浸濕的脫 脂棉與焦性沒(méi)食子酸接觸，然后置 37

6、C恒溫箱中培養(yǎng)之。干燥器培養(yǎng)法是于干 燥器底部放入氫氧化鈉溶液適量， 然后再放入 2-3 個(gè)略高于液面的玻璃圓柱 （如 鏈霉素小瓶），將適量焦性沒(méi)食子酸用紙或紗布包好，放置于圓柱上面，使暫勿 與氫氧化鈉接觸， 然后放下隔板， 將已接種的培養(yǎng)皿或試管置于隔板上， 待一切 準(zhǔn)備好后， 將蓋蓋好密封， 并輕輕搖動(dòng)干燥器， 使焦性沒(méi)食子酸落入氫氧化鈉溶 液中。（2）高層瓊脂柱搖震培養(yǎng)分離法取長(zhǎng)約15cm直徑約5mm0勺玻璃棒一支，一端塞以小木塞，另一端塞以棉 花塞，高壓滅菌備用； 加熱融化一管適合分離厭氧菌用的瓊脂培養(yǎng)基， 待冷卻至 50C左右，接入少許經(jīng)適當(dāng)稀釋的待分離的培養(yǎng)物或含菌材料，充分搖震均

7、勻； 在瓊脂凝固前，迅速以無(wú)菌滴管吸取上述已接種勺瓊脂培養(yǎng)基，注入上述（ 1） 準(zhǔn)備好的玻璃管，置恒溫箱中培養(yǎng)。（3）連二亞硫酸鈉法 將已接種的平板或斜面培養(yǎng)基，置于一玻璃干燥器（預(yù)先測(cè)出體積） ，按每1000ml容積稱(chēng)取連二亞硫酸鈉（又稱(chēng)保險(xiǎn)粉）和無(wú)水碳酸鈉各 4g,并分別研細(xì) 均勻，臨用前混合置于一平皿， 放在培養(yǎng)基上層， 然后將蓋蓋嚴(yán)， 用凡士林密封， 置37C恒溫箱中培養(yǎng)。2）二氧化碳培養(yǎng)法 少數(shù)細(xì)菌如布氏桿菌（牛型） ，在含有 10%二氧化碳的環(huán)境下生長(zhǎng)良好。要?jiǎng)?chuàng)造 這樣的環(huán)境， 常用的方法為燭缸法。 將接種的培養(yǎng)基置玻璃干燥器或其他可以密 閉的玻璃缸，于其點(diǎn)燃一小段蠟燭，加上蓋（蓋

8、邊涂凡士林以防漏氣） ，約一分 鐘左右蠟燭熄滅，此時(shí)缸氧氣已被耗盡，缸所含二氧化碳約10%。注意蠟燭勿太長(zhǎng)， 而且不宜靠近缸壁， 以免因局部玻璃過(guò)熱而破裂。 凡士林不能 太多也不能太少，多了蓋子滑落，少了則封口不嚴(yán)。4. 真菌的分離培養(yǎng)法（簡(jiǎn)單介紹）應(yīng)用細(xì)菌的平板分離法（劃線、傾注） ，能容易而滿(mǎn)意地得到真菌的純培養(yǎng)。 劃線法： 2-5 天長(zhǎng)霉菌。1）取瓊脂培養(yǎng)基熔化，冷卻至 45C，注入無(wú)菌平皿中，每皿15-20ml，作 成平板待用。2）取要分離的材料（如田土、混雜的或污染的真菌培養(yǎng)物、真菌）少許， 投入盛無(wú)菌水之試管中，搖振，使分離菌懸浮水中。3）將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌并冷卻后，蘸取上述懸浮液

9、，進(jìn)行平板劃線。4）劃線完畢，置溫箱中培養(yǎng) 2-5 天，待形成子實(shí)器官后，釣取單個(gè)菌落的 部分，制片檢查。 若只有一種菌生長(zhǎng)， 即得純種。 另外，亦可在放大鏡的觀察下， 用無(wú)菌鑷子夾取一段待分離的真菌菌絲， 直接放在平板上作分離培養(yǎng)， 即可獲得 該種真菌的純培養(yǎng)。5. 自患病動(dòng)物病料中分離病原菌方法（簡(jiǎn)單介紹）1 ）瓊脂斜面分離法 取瓊脂斜面三管，用接種環(huán)蘸取欲檢病料少許（如為臟器， 現(xiàn)將表面灼燒后，用滅菌解剖刀切開(kāi)，以接種環(huán)由切面釣取組織） ，混合于第一 管的凝集水中，再做斜面劃線；然后取出接種環(huán)，不經(jīng)燒灼，繼續(xù)在第二管、第 三管斜面上作同樣的劃線。劃畢，置溫箱中培養(yǎng)。經(jīng)此法分離培養(yǎng)后，第二

10、管的 菌落較第一管為少， 第三管的菌落更少， 如此較易得到單個(gè)菌落， 達(dá)到純培養(yǎng)之 目的。2）瓊脂平板涂布分離法 液體被檢病料如血液、腹水等，可用滅菌毛細(xì)吸管或 吸管吸取， 置 1-2 滴于平板中央， 用 L 形玻棒或玻璃刮鏟作均勻涂布。 如為臟器 病料，可先做成乳劑再行涂布；或取其一小塊，用鑷子夾住，表面燒烙后，用滅 菌刀切開(kāi)，以其切面直接進(jìn)行涂布。此法適用于含菌量較少的病料的分離。3）通過(guò)試驗(yàn)動(dòng)物分離法 被檢材料中疑有某種病原菌存在，可將病料接種于有 易感性的動(dòng)物體，如疑有豬丹毒桿菌存在的病料，可注射于鴿體，鴿死后，再取 其脾臟以分離豬丹毒桿菌，?？傻玫郊兣囵B(yǎng)。四、釣菌和純培養(yǎng)被檢材料經(jīng)分

11、離培養(yǎng)后， 選擇欲分離的可疑菌落， 用滅菌接種環(huán) （針）釣取少許， 接種在新的培養(yǎng)基上， 稱(chēng)為釣菌。 釣取一個(gè)菌落培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)菌培養(yǎng)物， 稱(chēng)為純 培養(yǎng)。純培養(yǎng)的目的在于進(jìn)一步進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)和其他試驗(yàn)研究。方法：首先用肉眼或放大鏡觀察并選擇可疑的單個(gè)菌落， 然后以蠟筆在可疑菌落 下面的平皿底上作一記號(hào)， 用滅菌的接種環(huán) （針）輕輕接觸菌落， 蘸取菌料少許， 作抹片，染色，鏡檢。如其形態(tài)一致， 即接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上， 置溫箱中培養(yǎng)。6. 細(xì)菌和真菌的移植方法（簡(jiǎn)單介紹）1）接種環(huán)移植法 :以左手持長(zhǎng)有細(xì)菌 （或真菌）的菌種和無(wú)菌的瓊脂斜面各一管， 管口并齊，管底握于掌中，以右手作握筆狀緊執(zhí)接種

12、環(huán)，并進(jìn)行火焰滅菌；以右 手的小指和無(wú)名指扭開(kāi)并夾住第一管的棉塞， 無(wú)名指和中指扭開(kāi)并夾住第二管的 棉塞，或以小指和無(wú)名指同時(shí)扭開(kāi)并夾住兩管的棉塞。 將管口通過(guò)火焰滅菌， 然 后用燒灼滅菌后的接種環(huán)插入菌種管， 釣取少許菌料，接種于無(wú)菌的瓊脂斜面上。 同樣將管口通過(guò)火焰滅菌后， 塞好棉塞， 最后將接種環(huán)燒灼滅菌， 用蠟筆在試管 上標(biāo)記菌名、日期，置溫箱中培養(yǎng)。 厭氧菌移植常用培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法如上述釣 菌項(xiàng)。2）吸管或注射器移植法 : 移植定量的液體培養(yǎng)或表面有液體石蠟的厭氧菌培養(yǎng) 物，一般也可以利用吸管或注射器移植， 其操作方法系以無(wú)菌吸管或無(wú)菌注射器 吸取培養(yǎng)物，代替接種環(huán)進(jìn)行移植。四、示教

13、1. 用普通瓊脂平板做一次劃線分離培養(yǎng)：點(diǎn)上酒精燈，取實(shí)驗(yàn)三所做好的普通 瓊脂平板，倒置，將培養(yǎng)基靠近酒精燈呈 45 度打開(kāi)，然后用鉑金耳釣取一環(huán)菌 在培養(yǎng)基上劃線，選四種（方格劃線、蛇形劃線、區(qū)域劃線、交叉劃線）畫(huà)法中 的一種。2. 用普通肉湯做一管大腸桿菌的移植培養(yǎng)：手拿大腸桿菌的培養(yǎng)試管和一管肉 湯培養(yǎng)基，充分震蕩?？拷凭珶簦茻芸?，充分灼燒鉑金耳，放到酒精燈旁 邊放涼，打開(kāi)試管塞，灼燒試管口，將鉑金耳釣取一環(huán)菌，然后將鉑金耳放到肉 湯培養(yǎng)基，搖晃。灼燒鉑金耳，灼燒試管口，把試管塞上。充分灼燒鉑金耳。將 接好試管和鉑金耳放到試管架。3. 用普通瓊脂斜面做一管金黃葡萄球菌的移植培養(yǎng)：

14、用相同的方法接種， 在斜邊 培養(yǎng)基 上劃線。放到溫箱培養(yǎng)。4. 用劃線法進(jìn)行真菌的分離培養(yǎng)（示教） ：與細(xì)菌的劃線培養(yǎng)相同，畫(huà)好線后放 如溫箱培養(yǎng)（30C）, 2-5天，待形成子實(shí)器官后，釣取單個(gè)菌落的部分，制片 檢查。若只有一種菌生長(zhǎng)，即得純種。另外，亦可在放大鏡的觀察下，用無(wú)菌鑷 子夾取一段待分離的真菌菌絲， 直接放在平板上作分離培養(yǎng)， 即可獲得該種真菌 的純培養(yǎng)。五、實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問(wèn)題 1）分離培養(yǎng)前應(yīng)考慮所分離的細(xì)菌的特性，選擇適合其生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基（需 氧還是厭氧、營(yíng)養(yǎng)的要求高還是不高、培養(yǎng)溫度等）等。例如：鏈球菌在普通瓊 脂不長(zhǎng)， 要加血清或血液。 大腸桿菌和葡萄球菌要求較低， 普

15、通的培養(yǎng)基即可生 長(zhǎng)。2）防止污染。分離培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作。培養(yǎng)基和一切用具必須徹 底滅菌；操作時(shí)必須靠近火焰；操作完畢后，禁止再讓培養(yǎng)基接觸外界空氣。3）防止接種器械過(guò)熱，很容易殺死分離培養(yǎng)的細(xì)菌，如接種環(huán)在燒灼滅菌后， 不能立即釣取細(xì)菌材料， 應(yīng)在酒精燈旁涼涼； 另外還應(yīng)注意防止已釣取菌料的接 種環(huán)，不慎通過(guò)火焰而將細(xì)菌殺死。4）初代分離時(shí)發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌，觀察找到目的菌落，再拿一肉湯培養(yǎng)基純化培 養(yǎng)。然后在接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，作成凝集抗原，做血清學(xué)鑒定， 。還可以反過(guò)來(lái)做抹 片染色觀察。六、作業(yè)1. 為什么要進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)？2. 進(jìn)行分離培養(yǎng)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？3. 細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法

16、有哪些？（重點(diǎn)敘述平板劃線法）4. 敘述真菌的劃線分離方法。七、本次實(shí)驗(yàn)總結(jié)1. 掌握劃線法，熟悉四種劃線方法。以及細(xì)菌的移植方法。2. 在操作過(guò)程中要防止污染。 分離培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作。 培養(yǎng)基 和一切用具必須徹底滅菌； 操作時(shí)必須靠近火焰； 操作完畢后， 禁止再讓培養(yǎng)基 接觸外界空氣。3. 操作的過(guò)程中要注意不要讓接種器械過(guò)熱。 防止殺死細(xì)菌或真菌， 如接種 環(huán)在燒灼滅菌后， 不能立即釣取細(xì)菌材料， 應(yīng)在酒精燈旁涼涼； 另外還應(yīng)注意防 止已釣取菌料的接種環(huán)，不慎通過(guò)火焰而將細(xì)菌殺死。八、附：實(shí)驗(yàn)四：細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所需物品一、試驗(yàn)材料名稱(chēng)組別數(shù)量合計(jì) 備注1、酒精燈5 2

17、10火機(jī)（柴）2、接種環(huán)5 2103、培養(yǎng)基自備用前融解普通瓊脂4、菌種大腸桿菌肉湯、金黃色葡萄球菌斜面每組各1 管5、病料糞便6、霉菌菌種7、真菌培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，應(yīng)提前制備平板每班2 個(gè)）8、9ml 生理鹽水試管 4 只9、5ml 吸管10、吸球11、酒精棉球二、儀器設(shè)備名稱(chēng)1、干燥箱 1 臺(tái)2、水浴鍋 1 臺(tái)3、培養(yǎng)箱 1 臺(tái)表1、試驗(yàn)儀器設(shè)備統(tǒng)計(jì)表學(xué)院牧醫(yī)工程實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)畜牧微生物實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)儀器設(shè)備名稱(chēng)數(shù)量 （臺(tái)、套）設(shè)備 現(xiàn)狀備注藥品柜2個(gè)有1個(gè)恒溫培養(yǎng)箱1臺(tái)有烘烤箱1臺(tái)已壞普通水箱1臺(tái)無(wú)低溫水箱（冰柜）1臺(tái)無(wú)咼壓滅菌器1臺(tái)已壞流通蒸汽火菌器1臺(tái)無(wú)水平式電動(dòng)離心機(jī)1臺(tái)無(wú)抽水機(jī)（真空泵）1臺(tái)無(wú)賽式細(xì)菌濾器1套無(wú)G1-6波動(dòng)濾器1套無(wú)顯微鏡32臺(tái)有超凈臺(tái)1臺(tái)無(wú)無(wú)菌室1個(gè)無(wú)試驗(yàn)臺(tái)7個(gè)有試驗(yàn)臺(tái)燈7套已壞4套表2、試驗(yàn)試劑消耗情況統(tǒng)計(jì)表學(xué)院牧醫(yī)工程實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)畜牧微生物實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)分類(lèi)X容 試劑名稱(chēng)、實(shí)驗(yàn)人數(shù)組數(shù)組試 均劑 消量 耗蒸八、餾 水單價(jià)5第応督再情 利況 用香柏油3261瓶5000ml二甲苯3261瓶牛肉膏培1瓶5000ml氯化鈉養(yǎng)1瓶蛋白胨細(xì)1瓶瓊脂粉菌1瓶堿性美蘭染1瓶KOH色1瓶草酸銨制1瓶結(jié)晶紫備1瓶碘片各1瓶碘化鉀種1瓶堿性復(fù)紅標(biāo)1瓶本片合計(jì)表3實(shí)驗(yàn)用低值易耗品及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物統(tǒng)計(jì)表系別： 牧醫(yī) 實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)