實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案書附技術(shù)路線

1、競賽設(shè)計(jì)及技術(shù)路線1. 研究目的本課題針對(duì)嚴(yán)重影響植物生長的安全因素一一軟腐害，在前期課題組研究 植物生物防治和保護(hù)的基礎(chǔ)上，選取南方紅豆杉為研究材料，通過對(duì)南方紅豆 杉內(nèi)生菌進(jìn)行分離和純化，進(jìn)一步通過拮抗實(shí)驗(yàn)，探索其對(duì)半夏軟腐病菌、白 菜軟腐病菌、番茄軟腐病菌等植物軟腐病菌的抑制效果，以期為半夏等中藥 材、白菜等農(nóng)作物等植物軟腐病的生物防治提供優(yōu)良的菌株材料，從而為植物 的綠色、安全、健康生長提供理論和技術(shù)支撐。2. 研究意義南方紅豆杉，作為植物資源庫中的一株奇葩，在材質(zhì)、藥用等方面起著非常 重要的作用，鑒于其富產(chǎn)紫杉醇等多種藥用活性物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，本課題旨在將南方紅豆杉資源進(jìn)一步優(yōu)化利用，深入

2、挖掘其在抗菌性、抗病性等方面的潛在價(jià)值。 植物內(nèi)生菌，作為一種新型微生物資源，目前受到了廣泛的關(guān)注，從內(nèi)生菌中尋 找和發(fā)現(xiàn)新的活性化合物已成為國內(nèi)外研究的又一熱點(diǎn)，近年來已發(fā)現(xiàn)了一些有醫(yī)用、農(nóng)用價(jià)值的菌株和化合物。本文主要以南方紅豆杉為研究對(duì)象，研究其內(nèi) 生菌的多樣性，并從中分離出對(duì)植物軟腐病菌具有抑制作用的拮抗菌株，以進(jìn)一步加強(qiáng)南方紅豆杉植株內(nèi)生菌的菌種研究，深化對(duì)植物軟腐病的防治作用研究， 并為生物防治菌劑的開發(fā)和研制積累理論基礎(chǔ)。為深入研究植物軟腐病的生物防 治機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為南方紅豆杉的資源應(yīng)用開辟新的途徑。3. 實(shí)驗(yàn)方案及技術(shù)路線3.1實(shí)驗(yàn)方案樣品采集南方紅豆杉植株采集時(shí)間為2012

3、年5月至8月，采集于浙江省金華市婺城 區(qū)南部山區(qū)，選取1-3塊代表性種植地，米用五點(diǎn)米樣法，米集南方紅豆杉整個(gè) 植株，每點(diǎn)5株，分別米取南方紅豆杉的根、莖、葉，存入牛皮紙帶，做好記錄， 立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。樣品處理及消毒3.121 表面消毒取采集的南方紅豆杉植株根、 莖、葉，用自來水充分沖洗后，分裝在三個(gè)平板上， 移至已滅好菌的超凈臺(tái)上，點(diǎn)燃酒精燈，用酒精擦拭手，首先將根用無菌水沖洗2次，再移至70%乙醇浸泡20S,再用2%次氯酸鈉浸泡2min,無菌水沖洗3次。保留最 后兩次沖洗液，取最后一次沖洗液適量于NA培養(yǎng)基中，進(jìn)行涂布，完成后注明標(biāo)記。 取根的最后第二次沖洗液將莖進(jìn)行第一次

4、沖洗，最后一次的沖洗液進(jìn)行莖的第二次 沖洗，依次進(jìn)行上述操作。消毒效果驗(yàn)證采用2種方法驗(yàn)證樣品表面消毒效果：組織印跡法：將以上消毒后的樣品， 貼放于NA培養(yǎng)基表面5min后，將培養(yǎng)皿于30°C培養(yǎng)3-5天，觀察微生物生長 情況。消毒液涂板法：將表面消毒的最后一次沖洗液涂布于 NA平板上，于30C 培養(yǎng)3-5天，觀察微生物生長情況。如果有菌生長，表明表面消毒不徹底。兩種 檢測方法均證明以上樣品處理和消毒方法可行。內(nèi)生菌分離內(nèi)生細(xì)菌、放線菌分離：樣品表面消毒、晾干后轉(zhuǎn)入加有9mL無菌水無 菌研缽中研磨勻漿，取原液、稀釋10倍液和100倍液，然后分別涂于NA/高氏1 號(hào)平板上,每個(gè)稀釋度設(shè)

5、3個(gè)重復(fù)，平板倒置在28 C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng) 24h，放線菌培養(yǎng)7-10d。內(nèi)生真菌分離：在無菌操作臺(tái)上將消毒后的材料用無菌刀切成小塊， 莖、 根：長度2cm左右，等距離均勻放置于含有鏈霉素濃度為 30mg/L的PDA平板培 養(yǎng)基上（3-4片/皿），設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在28 C的培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)5-7d。細(xì)菌、真菌、放線菌的純化和保存挑取平板上不同表面形態(tài)的細(xì)菌、真菌、放線菌單菌落，分別在NA/PDA高氏平板上劃線培養(yǎng)、分離、純化，然后將純化的菌株轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的試管斜面培養(yǎng) 基于4C保存。3.2拮抗菌初篩拮抗細(xì)菌的平板初篩采用濾紙片法和打孔法，拮抗真菌、放線菌采用對(duì)峙培 養(yǎng)法。321拮抗細(xì)菌

6、篩選濾紙片法：病原菌接種在牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h后，用無 菌水制成菌懸液備用。稀釋病原菌懸液濃度為104-105cfu/ml的菌液，然后吸取100卩l(xiāng)病原菌液涂NA平板，在涂好的平板上勻稱的粘上直徑為 7mm勺濾紙三片， 每片濾紙上點(diǎn)接上10卩l(xiāng)的供試菌（濃度約為108cfu/ml ），每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)， 然后置于28C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)，并記錄抑菌圈大小。 拮抗真菌篩選 病原菌及供試真菌的培養(yǎng)：病原菌接種在牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基上，28 C培 養(yǎng)24h后，用無菌水制成菌懸液備用。純化真菌接種到PDA培養(yǎng)基平板上，28C 培養(yǎng)3-5d。

7、拮抗性測定：在PDA平板上中央位置上點(diǎn)接上供試真菌，倒置于 28C培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)2天,然后在供試真菌的周圍涂布病原菌液（濃度為 104-105cfu/ml ），最 后倒置平板于28C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察抑菌帶的產(chǎn)生情況，并做相應(yīng)記錄。拮抗放線菌篩選 病原菌及供試放線菌的培養(yǎng)：病原菌接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，28C培養(yǎng)24h后，用無菌水制成菌懸液備用。純化放線菌接種到高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板 上, 28C培養(yǎng)5-7d，制成菌餅（7mm備用。 拮抗性測定：首先在NA平板中央位置接入培養(yǎng)5-7天的放線菌菌餅，置于28C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，然后在菌餅周圍均勻涂布培養(yǎng) 24h的病原菌液（濃度為 104-1

8、05cfu/ml ），然后平板置于28C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2天，觀察抑菌情況，并做 相應(yīng)記錄。3.2技術(shù)路線4. 研究進(jìn)度日期內(nèi)容6月20日-6月30日方案設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)器材材料的準(zhǔn)備7月1日-7月30 日采樣，內(nèi)生菌分離8月1日-8月30 日拮抗菌的活性鑒定9月1日-9月15日實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)9月 16日-10 月 20日撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，撰寫文章5. 預(yù)計(jì)成果本課題研究了南方紅豆杉內(nèi)生菌對(duì)影響植物安全生長的軟腐病的拮抗效果，試圖通過生物防治手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)半夏、白菜、番茄等植物軟腐病的生長直到 抑制作用。通過本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)以下兩個(gè)目標(biāo)：從南方紅豆杉中分離和純化細(xì)菌、 真菌和放線菌，通過統(tǒng)計(jì)分析南方紅豆

9、杉內(nèi)生菌的菌群類型； 進(jìn)一步確定以上 分離的內(nèi)生菌對(duì)半夏軟腐病菌的拮抗效果；與已有研究進(jìn)行比較分析。Soft rot, as a serious impact on plants ( such as pinellia,tomato, cabbage )growth factors on the biological en vir onment of safety, security and stability has great destructiveness. The soft rot by chemical means. This review summarized the soft ro