農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的概述

1、. 學(xué)年第學(xué)期2021級(jí)碩士生生物化學(xué)期末論文 任課教師： 開課學(xué)院： 課程名稱： 學(xué) 院： 專 業(yè)： 學(xué) 號(hào)： 姓 名： 2021 年6月20日. v.農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的概述摘要：自從1983年轉(zhuǎn)基因植物誕生以來(lái)，植物基因工程成為開展最快、應(yīng)用潛力最大的生物技術(shù)領(lǐng)域之一。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指把從動(dòng)物、植物或微生物中別離到的目的基因，通過各種方法轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，使之穩(wěn)定遺傳并賦予植物新的農(nóng)藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等。1目前，應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因較多的方法有基因槍轟擊法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。由于基因槍轟擊的隨機(jī)性，容易出現(xiàn)突變、喪失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的穩(wěn)定表達(dá)的缺點(diǎn)

2、，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定，是最常用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)2。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來(lái)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在一些單子葉植物尤其是水稻中也得到了廣泛應(yīng)用。本文對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法進(jìn)展綜述。關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化方法 轉(zhuǎn)化效率1關(guān)于農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌3-5是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性的感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。與植物基因轉(zhuǎn)化有關(guān)的有根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌這兩種類型。1.1根癌農(nóng)桿菌依據(jù)Ti質(zhì)粒誘導(dǎo)的植物細(xì)胞產(chǎn)生的冠癭堿的種類不同，根癌農(nóng)桿菌可分為4種類型：章魚堿型Octop

3、ine、胭脂堿型Nopaline、農(nóng)桿堿型Agropine和琥珀堿型Succinamopine。原始的Ti質(zhì)粒根據(jù)其功能的不同可分為4個(gè)區(qū)：1.1.1T-DNA區(qū)(TransferDNAregion)：不同來(lái)源的菌株，T-DNA的長(zhǎng)度在1224kb，它是在農(nóng)桿菌侵染細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物基因組中的一段DNA，其攜帶的基因與腫瘤的形成有關(guān)，但與T-DNA本身的轉(zhuǎn)移與整合無(wú)關(guān)T-DNA上最重要的是T-DNA區(qū)兩端的邊界各為25bp的重復(fù)序列其中14bp是完全保守的，分10bp(CAGGAATATAT)和4bp(GTAA)不連續(xù)的2組左右2個(gè)邊界(LB和RB)是TDNA轉(zhuǎn)移所必需的，

4、只要其存在，T-DNA可以將攜帶的任何基因轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，轉(zhuǎn)移的方向是從右向左，T-DNA的右邊界在T-DNA的整合中對(duì)于靶DNA位點(diǎn)的識(shí)別具有重要作用，因此，尤以右邊界更為重要。1.1.2毒性區(qū)(vir區(qū))：位于T-DNA以外的1個(gè)30-40kb的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)段編碼的基因雖然并不整合進(jìn)植物基因組中，但對(duì)T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合非常重要。這些基因也稱為Ti質(zhì)粒編碼毒性基因(vir)。目前，對(duì)章魚堿型農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTi15955和胭脂堿型農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTiC58的vir區(qū)進(jìn)展了全序列分析，在章魚堿型Ti質(zhì)粒的vir區(qū)發(fā)現(xiàn)了8個(gè)操縱子，分別為virA-vjrH，共包括23個(gè)基因(vir

5、A，virB1-virB11，virC1，virC2，virD1-virD4，virE1，virE2，virF，virG，virH)而胭脂堿型Ti質(zhì)粒的vir區(qū)不含vjrF和virH操縱子，它含有另一個(gè)基因tzs，也有學(xué)者認(rèn)為有大約35個(gè)vir基因成簇排布于vir區(qū)。1.1.3接合轉(zhuǎn)移區(qū)(Con區(qū))：該區(qū)段存在有與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因(tra)，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌間轉(zhuǎn)移。1.1.4復(fù)制起始區(qū)(ori區(qū))：該區(qū)段調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中除了Ti質(zhì)粒上的基因參與外，還有農(nóng)桿菌染色體基因染色體基因包c(diǎn)hvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB它們大多編碼一些膜相關(guān)

6、蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)菌向植物受傷細(xì)胞趨化移動(dòng)和幫助細(xì)菌附著于植物受傷細(xì)胞上。1.2發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)含有Ri質(zhì)粒，能夠誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根。其侵染植物是將其Ri質(zhì)粒上的T-DNA插入到宿主植物基因組中，這一點(diǎn)與Ti質(zhì)粒相類似。轉(zhuǎn)移機(jī)制也類似，所不同的是vir區(qū)和T-DNA區(qū)所含基因及其同源性不同。發(fā)根農(nóng)桿菌由于宿主植物損傷部位產(chǎn)生的酚類化合物而附著在植物的細(xì)胞壁上，virA的產(chǎn)物是一種跨膜蛋白，進(jìn)一步激活virG的產(chǎn)物。T-DNA區(qū)的TL區(qū)具有較高的穩(wěn)定性，TR區(qū)具有與生長(zhǎng)素合成有關(guān)的基因tmsl和tms2及農(nóng)桿堿或甘露堿合成基因。TR區(qū)

7、可進(jìn)展改造，這樣Ri通過農(nóng)桿菌細(xì)胞膜特定“孔道進(jìn)入宿主植物細(xì)胞核，進(jìn)而使T-DNA整合到植物基因組中。2轉(zhuǎn)化過程農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合是細(xì)菌和植物細(xì)胞相互作用發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的過程，兼具原核生物中的細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)移及真核細(xì)胞加工修飾的特點(diǎn)。其轉(zhuǎn)化過程6-8如下：2.1細(xì)菌在植物傷口處附著，使受傷的植物組織產(chǎn)生酚類化合物，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒內(nèi)vir基因的表達(dá)在植物受到創(chuàng)傷后，創(chuàng)傷組織的細(xì)胞釋放出酚類化合物信號(hào)，如乙酰丁香酮As。當(dāng)農(nóng)桿菌承受到此類信號(hào)時(shí)，其vir區(qū)基因可被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。另一類誘導(dǎo)化合物是組成植物細(xì)胞壁的一些特異單糖，As和單糖可協(xié)同誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上vir區(qū)基因的表達(dá)。Vir區(qū)基因的活化

8、首先是從virA基因開場(chǎng)的。VirA蛋白是一種結(jié)合在膜上的化學(xué)受體蛋白，可直接對(duì)植物產(chǎn)生的酚類化合物感應(yīng)，其感應(yīng)部位可能位于胞質(zhì)區(qū)域。VirA蛋白的胞質(zhì)區(qū)域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA結(jié)合活化蛋白，可以以二體或多體形式結(jié)合到vir啟動(dòng)子的特定區(qū)域，從而成為其它vir基因轉(zhuǎn)錄的激活因子，翻開VirB、virC、virD、virE、virH等幾個(gè)基因。virC、virD、virE參與T-DNA復(fù)合體的形成和轉(zhuǎn)移ChvE可結(jié)合一些單糖，也可直接與VirA周質(zhì)區(qū)相互作用，以加強(qiáng)As對(duì)Vir基因的誘導(dǎo)。2.2vir基因表達(dá)的產(chǎn)物作用于T-DNA產(chǎn)生T-DN

9、A鏈，進(jìn)而轉(zhuǎn)化形成T-DNA復(fù)合體，隨后在植物及細(xì)菌蛋白的共同作用下被攝入細(xì)胞核內(nèi)。VirD基因編碼的兩個(gè)產(chǎn)物VirD1和VirD2直接參與加工過程VirD1蛋白是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶，可將超螺旋型DNA變成松弛型DNAVirD2蛋白具有特異剪切單鏈DNA的內(nèi)切酶活性，它可以識(shí)別T-DNA底鏈邊界重復(fù)序列上的特定位點(diǎn)，并在底鏈24bp重復(fù)序列和第四個(gè)堿基之間切割，將T-DNA從Ti質(zhì)粒上剪切下來(lái)，稱T-鏈。切開T-DNA后，VirD2蛋白與T一鏈的5端共價(jià)結(jié)合，防止核酸外切酶降解T一鏈新的T-DNA底鏈以此鏈為模板，從右端產(chǎn)生的DNA缺口處以5-3方向進(jìn)展合成。被取代的舊鏈游離出來(lái)，與許多VirE2

10、蛋白分子結(jié)合組成T-DNA復(fù)合體。此外，VirD2作為一個(gè)導(dǎo)向蛋白，可以指導(dǎo)整個(gè)T-DNA復(fù)合體從農(nóng)桿菌進(jìn)入到植物細(xì)胞核。2.3T-DNA整合進(jìn)入植物基因組并表達(dá)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)T-DNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，是轉(zhuǎn)化過程中最重要也最關(guān)鍵的步驟。T-DNA在寄主細(xì)胞染色體上的整合是隨機(jī)的，但對(duì)轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域有所偏好。T-DNA通過與事先斷裂的寄主DNA雙鏈(DSB)發(fā)生重組來(lái)完成整合，進(jìn)而進(jìn)展表達(dá)。3轉(zhuǎn)化方法目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物最常用的方法是共培養(yǎng)法。利用農(nóng)桿菌與植物離體組織共培養(yǎng)進(jìn)展轉(zhuǎn)化，一般需要經(jīng)過嚴(yán)格的組織培養(yǎng)過程以再生植株，因而轉(zhuǎn)化周期比擬長(zhǎng)。共培養(yǎng)前農(nóng)桿菌感染愈傷組織的方式有：將整

11、塊愈傷組織浸泡于菌液中靜置培養(yǎng)。將整塊愈傷組織浸泡于菌液中搖動(dòng)培養(yǎng)。將菌液加至愈傷組織上。通常使用的是第一種方式?，F(xiàn)將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化常采用的方法9，簡(jiǎn)要介紹如下：3.1葉盤法選取安康的無(wú)菌苗，用打孔器打出葉圓盤，將帶有新鮮傷口的葉圓盤與載有目的基因的農(nóng)桿菌液進(jìn)展短期共培養(yǎng)，農(nóng)桿菌通過傷口使攜帶外源目的基因的Ti或Ri質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞，使外源目的基因整合到植物基因組中。它是雙子葉植物較為常用也較為簡(jiǎn)單有效的方法。3.2真空滲入法該法轉(zhuǎn)化的強(qiáng)健植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。它是一種簡(jiǎn)

12、便、快速、可靠而且不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉(zhuǎn)化植株的基因轉(zhuǎn)移方法，具有良好的研究與應(yīng)用前景。3.3原生質(zhì)體法在原生質(zhì)培養(yǎng)的早期，將攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體共同培養(yǎng)，農(nóng)桿菌的Ti或Ri就會(huì)隨著外源信號(hào)分子的誘導(dǎo)而導(dǎo)入原生質(zhì)體的核內(nèi)，T-DNA就可能整合在受體基因組上。此外，作為載體法，新的轉(zhuǎn)基因方法有：基于Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)建立的轉(zhuǎn)化載體；利用噬菌體P1Cre-lox位點(diǎn)的特異性重組系統(tǒng)；利用酵母線粒體I-Scel核酸內(nèi)切酶特異性誘導(dǎo)植物DNA雙鏈斷開引起的同源重組系統(tǒng)；利用雙鏈細(xì)菌人造染色體載體系統(tǒng)等，能夠提高轉(zhuǎn)化率或轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)質(zhì)量。4研究現(xiàn)狀關(guān)于禾谷類單子葉植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)

13、的遺傳轉(zhuǎn)化，早期的研究多采用其幼胚來(lái)評(píng)估不同條件下被農(nóng)桿菌侵染的可能性。結(jié)果顯示，T-DNA向禾本科植物中的轉(zhuǎn)化沒有明顯障礙，但人們對(duì)整合過程的了解十分有限，同時(shí)存在相當(dāng)大的爭(zhēng)議。在此根底上，人們利用大量實(shí)驗(yàn)去測(cè)試不同谷類植物的不同外植體對(duì)農(nóng)桿菌侵染的反響能力，以期獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株。Grimsley等1987首先將玉米條紋病毒(maizestreakvirus)的cDNA通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入玉米，轉(zhuǎn)入植株表現(xiàn)出感染病癥；Gould等1991用根癌農(nóng)桿菌感染玉米芽尖，得到少量轉(zhuǎn)基因植株；Shen等1993觀察到農(nóng)桿菌介導(dǎo)的gus基因轉(zhuǎn)入玉米芽后-葡糖苷酸酶的表達(dá)；Mooney等1991采用

14、根癌農(nóng)桿菌感染小麥胚得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞；Rainer等1990和Chan等1992通過根癌農(nóng)桿菌感染未成熟胚得到少量水稻轉(zhuǎn)基因植株。以上研究工作得到的轉(zhuǎn)化頻率很低，且沒有足夠的分子和遺傳證據(jù)，這些研究成果很少為大家承受并成認(rèn)，卻是鼓舞人心的，為單子葉植物尤其是禾谷類作物轉(zhuǎn)基因研究的進(jìn)一步開展奠定了根底。1993年-1994年取得了重大突破，Chan等1993以水稻開花授粉后10-12天的幼胚為受體，經(jīng)農(nóng)桿菌感染后獲得了轉(zhuǎn)基因植株；Hiei等1997以水稻成熟胚愈傷組織和未成熟幼胚為受體，獲得了較多有嚴(yán)格分子生物學(xué)證據(jù)的轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的影響因素進(jìn)展了詳細(xì)研究，建立了比擬成熟的農(nóng)桿

15、菌轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)體系，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化單子葉植物開辟了先河。從此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化X圍擴(kuò)展到了許多重要的單子葉植物，包括香蕉、玉米、大麥、小麥、甘蔗、大蒜、洋蔥、高梁和黑麥Chengetal1997；Ishidaetal199610-13。5存在問題與展望5.1植物受體因子與農(nóng)桿菌間的作用機(jī)理目前對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的機(jī)理及分子調(diào)控已研究比擬深入，但對(duì)有關(guān)植物因子的作用機(jī)理還知之甚少。許多研究說明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化已具備了與雙子葉植物相似的農(nóng)桿菌本身的必要條件，但單子葉植物的轉(zhuǎn)化相比擬而言困難得多，這可能不僅是農(nóng)桿菌一方的因素，單子葉植物的植物因子也可能起著關(guān)鍵作用，也不排除農(nóng)桿菌

16、和這些植物因子的相互作用14。5.2轉(zhuǎn)化率大多數(shù)單子葉植物的轉(zhuǎn)化受其基因型、外植體來(lái)源、組織培養(yǎng)難易程度等因素的影響，比擬難，以至在重要禾谷類作物中的應(yīng)用受到一定的限制，與雙子葉植物相比，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物還存在較大差距，其中煙草、葡萄等雙子葉植物的轉(zhuǎn)化效率高達(dá)60%以上，而單子葉植物中轉(zhuǎn)化效率較高的禾本科植物還不到30%(蔣玉寶等2005；孟芮等2006)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，單子葉植物用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得成功的遺傳轉(zhuǎn)化率玉米為5%-30%、水稻為29%、秈稻為22%，接近雙子葉植物(任永霞等2005)15。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有原生質(zhì)體法、葉盤法和整株感染法等。對(duì)于大多數(shù)單子葉植物的轉(zhuǎn)化，常

17、受基因型、外植體來(lái)源、組織培養(yǎng)難易程度等因素影響而很難成功，因此在許多重要禾谷類作物中的應(yīng)用受到限制。5.3Ti載體容量禾谷類作物的一些性狀，如抗病、抗蟲、抗逆、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等，或是數(shù)量性狀，或是質(zhì)量性狀相關(guān)的基因成簇排布，定位在較大的DNA片段。這些性狀的改造就需要一個(gè)能將大片段DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化體系。能攜帶大片段DNA的雙元細(xì)菌人工染色體和具轉(zhuǎn)化功能人工染色體分別對(duì)煙草和擬南芥的成功轉(zhuǎn)化Hamiltonetal1997；Liuetal1999，無(wú)疑對(duì)實(shí)現(xiàn)禾谷類作物中導(dǎo)入大片段DNA并進(jìn)展遺傳改進(jìn)具有重要意義李衛(wèi)等2000。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化也存在缺乏15-16。如農(nóng)桿菌感染過

18、程會(huì)對(duì)植物材料造成損傷，T-DNA整合時(shí)其邊界可能會(huì)發(fā)生截?cái)郒amidetal1996，T-DNA以串連形式整合，基因依賴性較高Leeetal1999，甲基化等原因造成基因表達(dá)失活Kumpaltaetal1997，1998；Pawlowskietal1998，轉(zhuǎn)移T-DNA區(qū)的兩個(gè)基因未必共表達(dá)等Hamidetal1996。另外，考慮到轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的平安性問題，培育具有平安選擇標(biāo)記或無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物也將成為植物基因工程研究的熱點(diǎn)之一。6完畢語(yǔ)隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛推廣，農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)化機(jī)理、轉(zhuǎn)化X圍、轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化策略等方面的進(jìn)一步深入研究，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域

19、中被廣泛應(yīng)用，成為獲得轉(zhuǎn)基因植物最常用的方法。參考文獻(xiàn)1X翼，路曦結(jié)，韓文兵等.轉(zhuǎn)基因技術(shù)在我國(guó)的研究、應(yīng)用現(xiàn)狀及展望.XX農(nóng)學(xué)通報(bào)A.2003,9(6):124-126.2耿立召，X傳亮，李付廣等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與基因槍轟擊法結(jié)合在植物遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用J西北植物學(xué)報(bào)，2005，25(1).3X惠展.基因工程M.:華東理工大學(xué),2005,3654王關(guān)林，方宏筠植物基因工程MI：科學(xué)，2002：452-4535任永霞,季靜,王里,王萍.植物遺傳轉(zhuǎn)化方法概述J.XX北方學(xué)院學(xué)報(bào).2005,21(6):38-42.6HellensR，MullineauxP'KLEEHAguidetoAgrobacteriumbinaryTivectorsTrendsinPlantScience，20005：446-4517