第四章中藥制劑的含量測定

1、第四章第四章 中藥制劑的含量測定中藥制劑的含量測定藥物分析教研室 朱麗麗含量測定的目的和意義u反映其制劑中有效成分或者毒性成分的含量u衡量其制劑工藝的穩(wěn)定性和中藥材的質(zhì)量優(yōu)劣 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 含量測定樣品的處理 常用含量測定方法 含量測定方法選定原則及驗證含量測定第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理 樣品基質(zhì)和成分組成復(fù)雜 被測成分含量低主要作用：主要作用：釋放被測組分，制成穩(wěn)定試樣除去雜質(zhì)，純化濃縮試樣形式符合測定的要求第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理 樣品的粉碎13 樣品的提取2 樣品的分離凈化萃取法、浸漬法、回流提取法、連續(xù)回流提取法、超聲提取法、水蒸氣蒸餾法、微波萃取法沉淀法、蒸餾法

2、、液液萃取法、色譜法、固相微萃取技術(shù)、消化法第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理一、樣品的粉碎目的： 取樣均勻，提取完全粉碎設(shè)備：粉碎機、研缽、銅沖、勻漿機l避免過細(xì)l避免樣品受污染l避免粉塵飛散及揮發(fā)性成分的損失l避免丟棄不易通過篩孔的部分顆粒第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理二、樣品的提取 對于中藥材和固體制劑樣品，在粉碎后，取粉末適量精密稱定，首先用溶劑進行提取，使被測組分和某些共存組分從中溶解出來（前者必須完全溶出），與濾渣分離后，再對被測組分進行含量測定。關(guān)鍵提取完全萃取法、浸漬法、回流提取法、連續(xù)回流提取法、超聲提取法、水蒸氣蒸餾法、微波萃取法2.1 萃取法 利用溶質(zhì)在兩種互不相溶溶

3、劑中的分配系數(shù)不同，使物質(zhì)從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，經(jīng)過多次萃取，將待測組分萃取出來的方法。l 相似相溶原理l 水相的pH影響弱酸弱堿性物質(zhì)在兩相的分配l 主要用于液體樣品中待測組分的萃取分離，多用有機溶劑將水相中的有機成分萃取出來l 注意防止和消除乳化l 酒劑和酊劑要先揮發(fā)除去乙醇第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理l長時間靜置l用濾紙過濾l離心分離l加乙醚第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理2.2 浸漬法 將樣品置于溶媒中浸泡一段時間分離出浸漬液。l分為冷浸法（室溫）和溫浸法（40 -60）l常用溶劑有甲醇、適當(dāng)濃度的乙醇和三氯甲烷l測定方法：全部測定法：過濾濾液蒸干定容測定（低濃）部分測

4、定法：過濾濾液取若干體積進行測定（高濃）l優(yōu)缺點及適用范圍：操作簡便，適用于熱不穩(wěn)定的樣品，提取雜質(zhì)較少，但是費時（12-24h），費溶劑（10-50倍）第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理2.3 回流提取法 將冷浸法中的帶塞容器換成回流裝置，用單一溶劑或混合溶劑于水浴上加熱回流提取，其余操作方法同冷浸法。 主要用于固體樣品的提取優(yōu)點： 1、提取效率高于冷浸法； 2、縮短提取時間，每次提取時間為0.5-2小時，直至提取完全為止。缺點：1、提取雜質(zhì)較多； 2、該法對熱不穩(wěn)定或具有揮發(fā)性的成分不宜使用。 第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理2.4 連續(xù)回流提取法 樣品置索氏提取器中，利用遇熱可以揮發(fā)的

5、溶劑進行反復(fù)提取（相當(dāng)于總是在使用新鮮溶劑提?。?，一般提取數(shù)小時方可完全。優(yōu)缺點及適用范圍：操作簡便，提取效率高，提取雜質(zhì)較少，所需溶劑少，受熱易分解的成分不宜使用。第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理2.5 超聲提取法 樣品置適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入提取溶劑，放入超聲振蕩器（超聲波清洗器）中進行提取。一般僅需數(shù)十分鐘。 優(yōu)點：超聲提取能使樣品粉末更好地分散于溶劑中提高提取效率和提取速度。缺點：促使化學(xué)反應(yīng)發(fā)生（如氧化還原反應(yīng)、大分子化合物的降解和解聚合作用等）。 第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理2.6 水蒸氣蒸餾法 將含有揮發(fā)性成分的樣品與水共蒸餾，使揮發(fā)性成分隨水蒸氣一并餾出，經(jīng)冷凝分取揮發(fā)性成

6、分的提取方法。 適用范圍： 具有揮發(fā)性、能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞、在水中穩(wěn)定且難溶或不溶于水的藥材成分的提取。第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理2.7 微波輔助萃取法 在樣品的提取過程中加入微波場，利用微波場的特點來強化有效成分浸出的新型提取技術(shù)。 優(yōu)缺點及適用范圍：l 設(shè)備簡單、適用范圍廣、萃取效率高、重現(xiàn)性好l 適用于熱穩(wěn)定性物質(zhì)關(guān)鍵溶劑的選擇第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理三、樣品的分離凈化 中藥液體制劑：萃取回收溶劑定容測定 中藥固體制劑：提純后純化分離進行測定所選測定方法的專屬性、分離能力、檢測系統(tǒng)對不純樣品污染的耐受程度等原則：從提取液中除去對測定有干擾的雜質(zhì)，而又不損失被測定成

7、分。依據(jù)：被測定成分和雜質(zhì)在理化性質(zhì)上的差異，結(jié)合測定方法的要求。關(guān)鍵保留有效成分第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理 沉淀法21 蒸餾法 液-液萃取法34 色譜法5 消化法6 固相微萃取技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理3.1 沉淀法 基于某些試劑與被測成分或雜質(zhì)生成沉淀，分離基于某些試劑與被測成分或雜質(zhì)生成沉淀，分離沉淀或保留溶液以得到精制的方法沉淀或保留溶液以得到精制的方法 l 除去試劑的干擾l 被測成分不能產(chǎn)生沉淀l 被測成分沉淀后，沉淀經(jīng)分離后可重新溶解或直接用重量法測定樣品+沉淀劑 沉淀過濾濾液測定 沉淀重量法或溶解后測定復(fù)方益母草口服液中水蘇堿的含量測定利用雷氏鹽（硫氰酸鉻銨）

8、作沉淀劑，在酸性介質(zhì)中可與大部分有機堿生成難溶于水的配合物與其它雜質(zhì)分離。 第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理3.2 蒸餾法 利用某些被測成分具有揮發(fā)性，可采用蒸餾法，收集餾出液進行含量測定，或某些成分經(jīng)蒸餾分解生成揮發(fā)性成分，利用分解產(chǎn)物（要求結(jié)構(gòu)明確）進行測定。w適用于具揮發(fā)性的待測組分，如揮發(fā)油、小分子的生物堿、丹皮酚等w最常用水蒸氣蒸餾法n共水蒸餾法n通水蒸氣蒸餾法n水上蒸餾法w利用鹽析作用，提高蒸餾效果第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理3.3 液-液萃取法直接萃取法n萃取劑的選擇 親脂性有機溶劑，如苯、氯仿或乙醚 弱親脂性的溶劑，如乙酸乙酯、正丁醇等n多次萃?。?-4次）n調(diào)整水相酸

9、度，提取有機酸、有機堿n利用鹽析作用，提高提取率第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理離子對萃取法原理：在適當(dāng)pH中，某些有機酸（堿）性物質(zhì)形成的離子與帶相反電荷的離子定量地結(jié)合成為弱極性的離子對，易溶于有機溶劑，使之萃取分離。適合于高度電離的有機酸、堿化合物的萃取l水相酸度的控制l離子對試劑的選擇l有機溶劑的選擇起源：1903年俄國植物化學(xué)家茨維特植物色素石油醚溶液3.4 色譜法第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理l 分離原理：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜l 操作方式：柱色譜、薄層色譜、紙色譜l 裝柱方法：濕法裝柱、干法裝柱l 操作程序：柱的活化；上樣；清洗；洗脫。l 微柱色譜（固相

10、萃?。?設(shè)備簡單、使用方便、快速、凈化效率高l 柱填料：硅膠、氧化鋁、鍵合相硅膠、大孔樹脂、聚酰胺、硅藻土、纖維素、離子交換樹脂等 固相萃取操作一般有四步：活化-除去柱子內(nèi)的雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)環(huán)境境。上樣-將樣品用一定的溶劑溶解，轉(zhuǎn)移入柱并使組分保留在柱上。淋洗-除去不需要的組分。洗脫-用小體積的溶劑將組分淋洗下來并收集。第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理硅膠、氧化鋁 硅膠：u作用機制：溶質(zhì)在吸附劑表面的極性吸附作用。非極性或極性低的雜質(zhì)先被洗出色譜柱，再用適當(dāng)極性的溶劑洗脫被測成分，而強極性的雜質(zhì)仍保留在柱上。u特點：通常適于酸性和中性物質(zhì)的分離；如分離堿性物質(zhì)，可在展開劑中加入少量稀堿

11、。？氧化鋁u分離機制：溶質(zhì)在吸附劑表面的極性吸附作用u堿性氧化鋁適于堿性和中性物質(zhì)的分離u酸性氧化鋁適于分析酸性和中性物質(zhì)u中性氧化鋁能將黃酮類成份吸附在柱上，可用于生物堿、苷的分離。 酸性氧化鋁對于富電子化合物具有更好的保留性。是使用酸性溶劑預(yù)處理過的，具有微弱陽離子特性，表面更易保留中性和帶負(fù)電荷的物質(zhì)，不能很好地保留帶正電荷的物質(zhì)。 堿性氧化鋁表面偏向于保留帶正電荷或是含氫鍵類物質(zhì)。是用堿性溶液預(yù)處理過的氧化鋁，具有陰離子特性并有陽離子交換功能，能保留給電子體樣品如：中性胺類化合物，相對于中性與酸性氧化鋁來說，這種能力要弱得多。堿性氧化鋁會有強氫鍵作用，所以對極性陽離子樣品的作用也很明顯

12、。第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理鍵合相硅膠（C18或或ODS）作用機制：借助化學(xué)反應(yīng)方法將固定液的官能團鍵合在硅膠的表面而構(gòu)成鍵合相硅膠。u有機硅烷與硅膠表面化學(xué)鍵合反應(yīng)，形成的-Si-O-Si-C-鍵是對溶劑、熱和化學(xué)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。u分開脂溶性和水溶性成分（苷元和苷的分離）u純化水基質(zhì)體液中憎水性藥物u洗脫順序：極性大小第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理大孔樹脂u 極性大孔樹脂：為丙稀酰胺聚合物，對極性化合物有相對強的吸附力u非極性大孔樹脂：為苯乙烯和二乙烯苯的共聚物，對非極性水溶性成分有吸附力u特點：表面積大，傳質(zhì)速率較高，具有不同的極性及適于吸附較大分子u使用前需要用有機溶劑除去雜質(zhì)，

13、有時還需用酸、堿清洗測定復(fù)方歸芪劑中的黃芪甲苷用大孔樹脂除去水溶性的多糖雜質(zhì)，再用30%乙醇洗脫黃芪甲苷。第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理聚酰胺機制：主要通過與溶質(zhì)形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用用于含酚、酸、醌類藥物樣品液的凈化分離。測定黃酮時，用樣品的乙醇提取液上聚酰胺柱，水洗去部分雜質(zhì)，以95%乙醇洗脫總黃酮后測定。 第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理硅藻土、纖維素親水性填料機制：分配作用應(yīng)用：多以水基質(zhì)液為固定相，與水不混溶的有機溶劑為流動相，較親脂的成分從固定相轉(zhuǎn)移到流動相，而被洗脫。萃取率較高（一般大于80%），無濃集作用，但洗脫劑用量較大（一般大于5ml）第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處

14、理離子交換樹脂特點：可除去樣品中的離子，防止組分分解，用于萃取樣品液中可解離化合物弱酸性藥物：中性和堿性條件下用陰離子交換樹脂柱，水及有機溶劑洗脫后，酸性溶液洗目標(biāo)成分離子交換樹脂中含有一種(或幾種)化學(xué)活性基團，即交換官能團，在水溶液中能離解出某些陽離子(如H+或Na+)或陰離子(如OH或Cl)，同時吸附溶液中原來存有的其他陽離子或陰離子。即樹脂中的離子與溶液中的離子互相交換，從而將溶液中的離子分離出來。第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理3.5 固相微萃取技術(shù)（SPME）uSPME是在固相萃取技術(shù)上發(fā)展起來的一種微萃取分離技術(shù)，是一種集采樣，萃取，濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品微萃取新技術(shù)。u

15、與固相萃取技術(shù)相比，固相微萃取操作更簡單，攜帶更方便，操作費用也更加低廉；另外克服了固相萃取回收率低、吸附劑孔道易堵塞的缺點。u主要用于分析揮發(fā)性、半揮發(fā)性物質(zhì)。3.6 消化法 測定中藥制劑中的無機元素u對樣品進行有機破壞，常用于中藥制劑中重金屬的檢查。u常用的破壞方法有濕法消化和干法消化法。濕法消化（強酸腐蝕）硝酸高氯酸法：適用于血，尿、組織等生物樣品和含動植物藥制劑的破壞（對含氮雜環(huán)類有機物破壞不夠完全）。 硝酸硫酸法：與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬離子的測定，不宜采有此法。 硫酸硫酸鹽法：常用于含砷或銻的有機樣品的破壞，破壞后得到三價砷或銻。 濕法消化所用的儀器，一般為硅玻璃或硼玻璃制成的

16、凱氏瓶（直火加熱）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加熱）。所用試劑應(yīng)為優(yōu)級純，水應(yīng)為去離子水或高純水，同時必須按相同條件進行空白實驗校正。操作時應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進行。 第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理 干法消化高溫?zé)胱?將有機物灼燒灰化以達(dá)分解的目的，本法不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機樣品的破壞。 常加無水Na2CO3或輕質(zhì)MgO等以助灰化。 加熱灼燒時，控制溫度在420以下，以免某些被測金屬化合物的揮發(fā)。 經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但此時切勿棄去。 第一節(jié)第一節(jié) 樣品的處理樣品的處理第二節(jié)第二節(jié) 常用含量測定方法常用含量測定方法l化學(xué)分析法 l可見-紫外分光光度法 l薄層掃描法

17、l氣相色譜法 l高效液相色譜法 l毛細(xì)管電泳法 l原子吸收分光光度法 第二節(jié)第二節(jié) 常用含量測定方法常用含量測定方法一、化學(xué)分析法 以物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)的經(jīng)典分析方法。l化學(xué)分析法所用儀器簡單，結(jié)果準(zhǔn)確。l主要用于測定制劑中含量較高的一些成分及含礦物藥制劑中的無機成分，如總生物堿類、總酸類、總皂苷及礦物藥制劑等。l化學(xué)分析法有一定的局限性，其靈敏度低，操作繁瑣、耗時長，專屬性不高，對于微量成分準(zhǔn)確性不理想。l包括重量分析和滴定分析。第二節(jié)第二節(jié) 常用含量測定方法常用含量測定方法（一）重量分析法 重量法可分為揮發(fā)法、萃取法和沉淀法。1、揮發(fā)法 又叫汽化或干燥法，可測定具有揮發(fā)性或能定量轉(zhuǎn)化為揮

18、發(fā)性物質(zhì)的組分含量。如：供試品的干燥失重測定；水分測定均屬揮發(fā)法；中藥制劑分析中灰分及熾灼殘渣的測定等。l 第二節(jié)第二節(jié) 常用含量測定方法常用含量測定方法2、萃取法 根據(jù)被測組分在互不相溶的兩相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。如冰硼散中冰片的含量測定；地奧心血康膠囊中甾體總皂苷含量測定；昆明山海棠片中總生物堿的含量測定；甘草浸膏中甘草酸的含量測定即采用萃取法。l 第二節(jié)第二節(jié) 常用含量測定方法常用含量測定方法3、沉淀法 將被測組分定量轉(zhuǎn)化為難溶化合物，以沉淀的形式從溶液中分離出來，經(jīng)濾過、洗滌、干燥、稱重，以稱量形式轉(zhuǎn)換測定其含量的方法，適用于制劑中純度較高的成分。如西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量

19、測定；苦參片中苦參總堿的含量測定；復(fù)方元胡注射液總堿的測定。 第二節(jié)第二節(jié) 常用含量測定方法常用含量測定方法（二）滴定分析法l酸堿滴定法：測定生物堿、有機酸、內(nèi)酯類 l沉淀滴定法： 銀量法：生物堿的氫鹵酸鹽及有機鹵化物 四苯硼鈉法：+生物堿白色沉淀 亞鐵氰化鉀法l配位滴定法（EDTA法和硫氰酸銨法）：測定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量l氧化還原滴定法：酚類、糖類及礦物藥中Fe、As等 第二節(jié)第二節(jié) 常用含量測定方法常用含量測定方法1、酸堿滴定法 適用于測定中藥制劑中所含有的生物堿、有機酸、內(nèi)酯類等酸、堿組分的含量。直接滴定：對于KC10-8的酸、堿組分

20、，可在水溶液中直接滴定。如：止喘靈注射液中總生物堿的含量測定、顛茄酊中生物堿的含量測定。間接滴定或非水滴定法：弱有機酸、生物堿或水中溶解度很小的酸、堿。如大山楂丸中總酸性物質(zhì)的含量測定、草烏注射液中生物堿的含量測定等。第二節(jié)第二節(jié) 常用含量測定方法常用含量測定方法2、沉淀滴定法 以沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)沉淀滴定法必須滿足的條件：1.S小，且能定量完成；2.反應(yīng)速度大；3.有適當(dāng)指示劑指示終點；4.吸附現(xiàn)象不影響終點觀察。l銀量法適用于測定中藥中無機鹵化物、有機氫鹵酸鹽及有機鹵化物 l四苯硼鈉法適用于測定生物堿的含量l亞鐵氰化鉀法 3、氧化還原滴定法用于測定氧化還原性物質(zhì)，酚類、糖類、含F(xiàn)e、As的中藥

21、制劑。包括碘量法、高錳酸鉀法和亞硝酸銀法4、配位滴定法用以測定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量。包括EDTA法和硫氰酸銨法。應(yīng)用實例：1、昆明山海棠片的含量測定重量法2、復(fù)方陳香胃片的含量測定滴定分析法3、柏子養(yǎng)心片的含量測定滴定分析法滴定度滴定度每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y藥物質(zhì)量。中國藥典用毫克（mg）表示。用碘量法測定維生素C的含量時，中國藥典規(guī)定：每1ml碘滴定液（0.05mol/L）相當(dāng)于8.806mg的維生素C（C2H8O6）dDcCbBaA被測藥物被測藥物 滴定液滴定液滴定度計算滴定度計算用用B來來滴定滴定AWAWBaMAbMB=滴定

22、液反應(yīng)的質(zhì)量滴定液反應(yīng)的質(zhì)量被測藥物反應(yīng)的質(zhì)量被測藥物反應(yīng)的質(zhì)量被測藥物的摩爾質(zhì)量被測藥物的摩爾質(zhì)量滴定液的摩爾質(zhì)量滴定液的摩爾質(zhì)量ABABBAMbanMbMWWABBMbaVm滴定度計算滴定度計算用用B來來滴定滴定A滴定液滴定液待測液待測液等于等于1ml濃度乘體濃度乘體積積=nB濃度濃度mBMbam)ml/mg(T滴定度：單位體積（VB=1 mL）的滴定液相當(dāng)于被測藥物的量，以T 表示，量綱為 mg/mL。m: 滴定液的摩爾濃度（mol/L）a：被測藥物的摩爾數(shù)b：滴定劑的摩爾數(shù)M：被測物摩爾質(zhì)量（mg）二、紫外-可見分光光度法 根據(jù)物質(zhì)分子對200-760nm波長范圍的電磁波的吸收特征建立

23、起來的光譜分析方法。l該法靈敏度高，精度好和操作簡便。l要求被測成分本身或其顯色產(chǎn)物對可見紫外光具有選擇性吸收。？l定量依據(jù)是Lambert-Beer定律？l按測定波長數(shù)目不同分為單波長光譜法和多波長光譜法。 （一）單波長分光光度法l 吸收系數(shù)法 A=ECL（百分吸收系數(shù)，單位g/100ml） 朗伯-比爾定律：物質(zhì)對單色光吸收特性與濃度、液層厚度關(guān)系定律 l 對照品比較法 對照品溶液濃度應(yīng)與供試品濃度接近（10010）l 標(biāo)準(zhǔn)曲線法三、薄層色譜掃描法 樣品經(jīng)薄層分離后，用一定波長的光掃描吸收紫外可見光的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點，用薄層色譜掃描儀（光密度計）測量被斑點反射或斑點發(fā)射的光

24、束強度的變化而定量，可用于藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定。根據(jù)薄層掃描的測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。3.1、薄層吸收掃描法l適用于在可見光區(qū)、紫外光區(qū)有吸收的物質(zhì)及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分。l以鎢燈和氘燈為光源。l在200-800 nm波長范圍內(nèi)選擇合適波長測定。l定量分析的理論依據(jù) Kubelka-Munk曲線薄層是由許多細(xì)小顆粒組成的半透明物體，光照射到薄層表面，除透射光、反射光外，還有相當(dāng)多的散射光，因此與光照透明溶液不同，樣品量與測得值之間呈非線性關(guān)系，特別在高濃度區(qū)，這樣就給定量工作帶來困難，為此有以下三種途徑來解決薄層上的定量問題。一、基

25、本原理一、基本原理a 選取曲線中的直線部分用于定量分析在低濃度范圍內(nèi)，樣品量與測得值間可存在線性關(guān)系，此法最簡便，也是在沒有線性化功能的薄層色譜儀上最常用的方法，但由于線性濃度范圍有限，故應(yīng)用上有一定限制b . Kubelka-Munk 方程光照到散射物質(zhì)表面，光的行為比較復(fù)雜，Kubelka 及Munk 從理論上推導(dǎo)出簡化的方程式，現(xiàn)應(yīng)用于薄層掃描。散射參數(shù)（SX） SX=0（即薄層固定相無散射作用）時，A與KX呈線性關(guān)系，服從Beer定律。 SX0時，透射法的A值隨著SX增大而增大，而反射法的A值隨SX的增大而減小。c 利用非線性方程定量利用計算機先求出非線性方程，然后在測定樣品時將測定值

26、輸入計算機，由此方程求出樣品濃度。瑞士Camag 公司的薄層掃描儀即根據(jù)此原理進行測定，并認(rèn)為這種方法更為合理，測定值更準(zhǔn)確可靠。3.2、薄層熒光掃描法l基本原理：F=KCl光源：氙燈或汞燈。l靈敏度：最低可測到10-50 pg。l適用范圍：適合于本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測定。lKubelka-Munk理論不適用于薄層熒光掃描，無需進行曲線校直。用薄層熒光掃描進行定量分析時，用斑點熒光強度的積分值（色譜峰峰面積）與斑點中組分的含量代替上式中F與C 進行運算。薄層色譜的規(guī)范化操作1、儀器與材料薄層板；涂布器；點樣器材；展開箱（層析缸）顯色與檢測儀器2、操作方法薄層板的制備；

27、點樣；展開；檢測；二、定量分析方法二、定量分析方法1、方法學(xué)考察 新建薄層掃描定量方法必須進行方法考察，以說明新建方法的可靠性，考察的內(nèi)容有工作曲線、定量結(jié)果的精密度及準(zhǔn)確度、統(tǒng)計檢驗等內(nèi)容。l 工作曲線l 精密度考察l 準(zhǔn)確度考察l 分離度考察適于用Kubelka-Munk曲線校直法進行定量校準(zhǔn)的儀器檢查所選擇的散射參數(shù)SX值是否適宜。SX值適宜則工作曲線被校為直線，否則，調(diào)整SX值再校正，直至工作曲線成直線為止?？疾旃ぷ髑€是否過原點，以確定采用一點法或二點法定量。確定點樣量的線性范圍。即使采用曲線校直，也只是在一定點樣量范圍內(nèi)工作曲線為直線，因此需確定點樣量的上、下限。精密度考察 取同一

28、供試品溶液，在同一塊薄層板上以相同點樣量平行點6點以上，展開后測定其峰面積，求算相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），作為衡量定量分析結(jié)果精密度的指標(biāo)。RSD應(yīng)小于3.0%；需顯色后測定的RSD應(yīng)小于5.0%。 式中：為n次測量的平均值，S為標(biāo)準(zhǔn)差。%100(%) XSRSD準(zhǔn)確度考察 回收率是衡量定量方法準(zhǔn)確度的指標(biāo)，常用加樣回收率（R）來衡量，其值應(yīng)在95-105%之間，測量數(shù)據(jù)一般為5-6個。 將加入純品的試樣溶液、供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液點于同一塊薄層板上，展開后進行薄層掃描，測定各斑點的峰面積，計算各溶液中組分的量，計算回收率（R）。加加入入純純品品量量供供試試品品中中被被測測組組分分量量加加入入純純品

29、品后后測測得得總總量量100% R分離度考察 分離度又稱分辨率,為了判斷物質(zhì)的分離情況,常用分離度作為分離效能指標(biāo).用R表示.R等于相鄰峰保留時間之差與兩峰峰寬均值之比。除規(guī)定外，R應(yīng)大于1.0。2、定量方法 外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、追加法及回歸曲線定量法 外標(biāo)法： 方法簡便，但點樣必須準(zhǔn)確。外標(biāo)一點法 工作曲線通過原點（截距為零）時可用外標(biāo)一點法定量。只需點一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，與供試液同板展開，對比，測定組分含量，其計算公式為：C=F1A 式中：C為組分的重量或濃度，A為測得該組分的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)。外標(biāo)二點法 工作曲線不通過原點時，只能用外標(biāo)二點法定量，至少需點二種不同濃度的標(biāo)

30、準(zhǔn)溶液（或一種濃度兩種點樣量），才能決定一直線,其計算公式為：C=F1A+F2 式中：C、A同前，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為縱坐標(biāo)的截距，F(xiàn)1和F2值由儀器自動算出。注意事項：l 點樣量必須準(zhǔn)確，宜用自動點樣儀或定量毛細(xì)管點樣。l 采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法，即供試品與標(biāo)準(zhǔn)品交叉點在同一板上；l 為減小誤差，同一薄板上供試品點樣不得少于4個，對照品每一濃度不得少于2個；l 調(diào)整供試品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的點樣量，使其峰面積相接近；內(nèi)標(biāo)法： 內(nèi)標(biāo)法是選一個純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，并準(zhǔn)確稱取一定量內(nèi)標(biāo)物加至供試液及標(biāo)準(zhǔn)液中，計算供試品溶液中某組分含量的定量方法。 內(nèi)標(biāo)物的選擇要求是：l純度合乎要求，展開后不得有雜質(zhì)斑

31、點，否則內(nèi)標(biāo)斑點的峰面積將不能代表內(nèi)標(biāo)物的量。l內(nèi)標(biāo)物須為樣品中所不含有的成分。l內(nèi)標(biāo)物不與其它斑點相重疊，分離度合乎要求。l為簡化計算，內(nèi)標(biāo)物在標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液中的濃度應(yīng)相等。內(nèi)標(biāo)一點法：當(dāng)工作曲線通過原點時采用內(nèi)標(biāo)一點法。內(nèi)標(biāo)一點法公式： 工作曲線不通過原點時必須采用內(nèi)標(biāo)二點法內(nèi)標(biāo)二點法公式： 式中：C、Cis分別為組分及內(nèi)標(biāo)物的濃度或重量，A、Ais分別為測得組分及內(nèi)標(biāo)物的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為截距，F(xiàn)1和F2由儀器自動計算并內(nèi)存，可直接給出樣品的濃度或重量。isisAAFCC1 21FAAFCCisis 特點：1.在一定點樣量范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確度與點樣量無關(guān)

32、。2.不易找到適宜Rf值的純品內(nèi)標(biāo)物，且溶液配制等操作較麻煩。回歸曲線定量法 將不同濃度（或不同量）的標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試液點在同一塊薄層板上，展開、掃描;由計算機對所測得的峰面積及相應(yīng)點樣量進行線性或非線性回歸;直接由回歸方程或回歸曲線計算供試液含量的方法;追加法（疊加法）影響薄層色譜分析的主要因素l 樣品的預(yù)處理及供試液的制備l 薄層色譜的點樣技術(shù)l 吸附劑的活性與相對濕度的影響l 溶劑蒸氣在薄層色譜中的作用l 溫度的影響氣相色譜法是以氣體為流動相的柱色譜分離分析方法。 l 原理：氣相色譜是根據(jù)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱，由于各組分在兩相間作用不同，在色譜柱中移動有快慢，經(jīng)一定柱長后得到分離，

33、依次被載氣帶入檢測器，將各組分濃度或質(zhì)量變化轉(zhuǎn)換成電信號變化記錄成色譜圖，利用色譜峰保留值進行定性分析，利用峰面積或峰高進行定量分析的方法。l 特點：分離效能高、選擇性好、靈敏度高，樣品用量少及分析速度快等特點，兼具分離、分析的功能。l 適用范圍：適用于熱穩(wěn)定性好的易揮發(fā)性或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性組分的分析。四、氣相色譜1、塔板理論 將色譜柱的柱效用理論塔板數(shù)n或理論塔板高度H衡量，取決于區(qū)域?qū)挾龋?、W1/2、W），其計算公式為n= 2 Rt=5.54 22/ 1 WtR=16 2 WtRH=L/n 適中：tR為組分的保留時間，、W1/2、W分別為組分的標(biāo)準(zhǔn)差、半峰寬和基線寬度。四、氣相色譜 若以調(diào)

34、整保留時間tR代替tR，則得到反映色譜柱實際柱效的有效理論塔板數(shù)neff。2 Rtneff= =5.54 22/ 1 WtR=16 2 WtRHeff=L/neff 可見，當(dāng)tR一定時，峰越窄，則H越小，n越大，柱效越高，分離性能越好。 四、氣相色譜2、速率理論 速率理論研究了色譜過程中各種動力學(xué)因素對柱效（峰展寬）的影響，提出了Van Deemeter方程式：H=A + B/u + Cu A、B/u、Cu分別為渦流擴散項、分子擴散（縱向擴散）項、傳質(zhì)阻抗項，從而解釋了板高隨載氣流速而改變，且有最佳流速（Hmin）的現(xiàn)象。速率方程式對于色譜分離條件的選擇具有指導(dǎo)意義，它可以說明色譜柱的填充均勻

35、程度、載體粒度、載氣種類、柱溫和固定液膜厚度對柱效、峰擴張的影響。 四、氣相色譜一、系統(tǒng)適用性試驗（1）色譜柱的理論板數(shù)n在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時間tR和半峰寬Wh/2，按計算色譜柱的理論板數(shù)。若測得理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、柱填充等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。 22154. 5 WtnR四、氣相色譜（2）分離度的計算 分離度是衡量分離效果的指標(biāo)，以相鄰兩色譜峰峰尖距對峰寬均值的倍數(shù)表示，其定義式為： 2/2112WWttRR 21122WWttRR 兩峰

36、基本分離，R1.5兩峰完全分離。 分離度的影響因素很多，可用基本分離方程式概括如下：a、b、c分別為柱效項，柱選擇性項和柱容量項。R=R= 22114kkn a b c四、氣相色譜（3）重復(fù)性 取各品種項下的對照溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%，也可按各品種校正因子測定項下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進樣3次，計算平均校正因子，其相對平均偏差也應(yīng)不大于2.0%。 四、氣相色譜式中，W0.05h為0.05峰高處的峰寬，d1為峰極大至峰前沿之間的距離，除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95

37、-1.05之間。（4）拖尾因子T 為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子T是否符合各品種項下的規(guī)定，或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為：105. 02dWhT=四、氣相色譜二、實驗條件的選擇1、固定相的選擇 1）氣液色譜 固定液：按極性相似、化學(xué)官能團相似的相似性原則和主要差別選擇。 載體：一般為適宜粒度，經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土。 2）氣固色譜：固定相大多采用高分子多孔微球（GDX），用于分離水及含羥基（醇）化合物。四、氣相色譜2、柱溫的選擇 選擇的基本原則：在使最難分離的組分有符合要求的分離度的前提下，盡可能采用較低柱溫，但以保留時間適宜

38、及不拖尾為度。l 高沸點的樣品（沸點300-400），采用1-5%低固定液配比，柱溫200-250。l沸點為200-300的樣品，采用5-10%固定液配比，柱溫150-180。l沸點為100-200的樣品，采用10-15%固定液配比，柱溫選各組分的平均沸點2/3左右。l氣體等低沸點樣品，采用15-25%高固定液配比，柱溫選沸點左右，在室溫或50下進行分析。l對于寬沸程樣品，需采用程序升溫方法進行分析。但需注意的是柱溫要低于固定液的最高使用溫度。四、氣相色譜3、載氣的選擇 主要從對峰展寬（柱效）、柱壓降和檢測器靈敏度的影響三方面考慮。lN2是最常用的載氣；l載氣流速較低時，宜用N2；流速高時，宜

39、用H2、He；l較長色譜柱，宜用H2作載氣；l熱導(dǎo)檢測器應(yīng)選用H2、He；氫焰檢測器、電子捕獲檢測器，一般用N2；l一般控制載氣流速高于其最佳流速。常用的載氣流速為20-80 ml/min。四、氣相色譜4、其他條件的選擇l氣化室（進樣口）溫度：樣品的沸點或稍高于沸點，不超過沸點50l檢測室溫度 100-300 l進樣量 在檢測器靈敏度足夠的前提下，盡量減少進樣量，通常以塔板數(shù)下降10%作為最大允許進樣量。5、檢測器熱導(dǎo)檢測器（TCD），氫焰離子化檢測器（FID），氮-磷檢測器（NPD），電子捕獲檢測器（ECD）四、氣相色譜三、定量分析方法 氣相色譜常用的定量方法有內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、歸一化法等。1

40、、內(nèi)標(biāo)法為最常用的定量方法l 優(yōu)點：可抵消儀器穩(wěn)定性差、進樣量不夠準(zhǔn)確等原因所帶來的定量分析誤差；l 缺點：樣品的配制較麻煩，有些內(nèi)標(biāo)物不易尋找。l 關(guān)鍵：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。l 適用范圍： 適用于樣品的所有組分不能全部流出色譜柱；檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號；只需測定樣品中某幾個組分含量時的情況。內(nèi)標(biāo)物的選擇原則： 應(yīng)是樣品中不存在的純物質(zhì)。加入量應(yīng)接近于被測成分。其色譜峰應(yīng)位于被測成分色譜峰附近且與之完全分離。 四、氣相色譜原理：選擇一內(nèi)標(biāo)物，將一定量的內(nèi)標(biāo)物加入到樣品中，根據(jù)試樣重量W和內(nèi)標(biāo)物重量Ws及待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積Ai、As，求出待測組分的含量。ssiisiAfAfWW待測組

41、分百分含量為：Ci%= %100%100sssiisssiiiCAfAfWAfWAfWW 式中fi、fs分別為被測組分和內(nèi)標(biāo)的重量校正因子。四、氣相色譜l 內(nèi)標(biāo)法加校正因子l 內(nèi)標(biāo)對比法l 內(nèi)標(biāo)工作曲線法%/%/RRSSSSRRsRCACAAWAWfff%SsXXCAAfC標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品%)(%)()/()/(iiiiCCAAAsAS標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品%)()/()/(%iiiSiCAAAsACAi/As對C作圖四、氣相色譜2、外標(biāo)法關(guān)鍵：進樣量準(zhǔn)確；實驗條件恒定。分類：1）工作曲線法：用一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，在完全相同條件下，準(zhǔn)確進樣等體積的樣品溶液，計算其含量；2）外標(biāo)一點法：當(dāng)

42、工作曲線截距為零時，可采用外標(biāo)一點法定量CrArAxCx 四、氣相色譜%100%100%iiiiiiiAfAfWWC面積歸一化法計算：%100%iiiAAC3、歸一化法 關(guān)鍵：要求所有組分均要產(chǎn)生色譜峰。 適用范圍：通常只能用于粗略考察供試品的雜質(zhì)含量，一般宜用于微量雜質(zhì)的含量檢查。校正面積歸一化法測定各組分的含量。四、氣相色譜五、高效液相色譜高效液相色譜法（HPLC）是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜的理論和實驗方法。高壓輸送流動相，采用高效固定相及在線檢測等手段發(fā)展而來的分離分析方法，具有分離效能高、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等特點。適用范圍：適用于極性、非極性化合物，離子型化合物和高分子

43、化合物的分離分析。如蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、甾體、類脂、核酸、維生素及無機鹽類 特點：流動相為液體，黏度大，柱溫低，擴散系數(shù)很小五、高效液相色譜（一）HPLC實驗條件的選擇1、色譜柱的選擇 根據(jù)被分離物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和溶解度等因素進行選擇。大多數(shù)藥物可用C18反相（ODS）柱加以分離測定；也可選用正相分配色譜柱（氨基柱、氰基柱）或硅膠吸附色譜柱等；解離藥物可用離子對色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測定；脂溶性藥物異構(gòu)體的分離測定可采用硅膠吸附色譜柱。五、高效液相色譜2、流動相的選擇a/反相鍵合相色譜流動相常用溶劑適用范圍部分含水溶劑甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)用于分離中等極性、弱極性藥物非水

44、溶劑乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氫呋喃等用于分離疏水性物質(zhì)緩沖溶液三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液用于可溶于水并具可解離特性的化合物五、高效液相色譜b/正相鍵合相色譜常采用飽和烷烴（如正已烷）中加入一種極性較大的溶劑作為極性調(diào)節(jié)劑（如異丙醚），通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度改變?nèi)軇姸?；常采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)。 五、高效液相色譜3、洗脫方式等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相的組成保持恒定，使所有組分的k值都處于這個范圍內(nèi)，適用于組分?jǐn)?shù)較少、性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成（如溶劑極性、離子強度和pH值等），適用于分析組分?jǐn)?shù)多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物樣品，從而使所有

45、組分都在適宜條件下獲得分離。 五、高效液相色譜電化學(xué)檢測器(ECD)用于能氧化、還原的有機物質(zhì)的檢測110-12g/ml適用生物胺、酚、羰基化合物、巰基化合物等示差折光檢測器(RID)屬通用型檢測器,利用組分與流動相折射率之差進行檢測. 穩(wěn)定性好,操作方便.靈敏度低,受環(huán)境溫度、流動相組成等波動的影響大,不適合梯度洗脫10-8g/ml尤其適合于糖類的檢測化學(xué)發(fā)光檢測器(CLD)高選擇性、高靈敏度的新型檢測器. 設(shè)備簡單,自身發(fā)光,無需光源,價格便宜Pg級(10-12)用于分析微量脂質(zhì)、核酸、生物胺等4、檢測器檢測器特點最低檢測限適用范圍紫外檢測器（UV或UVD）分為:可變波長型二極管陣列檢測器

46、 用于檢測有外吸收的物質(zhì); 靈敏度較高,噪音低,線性范圍寬,對流速和溫度波動不靈敏,可用于梯度洗脫.10-7-10-12g用于芳烴、稠環(huán)芳烴、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、羰基和羧基化合物等熒光檢測器(FD) 用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì); 靈敏度高于紫外檢測器11010g/ml主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合化物及酶等蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)屬通用型檢測器,理論上可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣品組分; 檢測靈敏度較低,適用于流動相能揮發(fā)的色譜洗脫,不能用含緩沖鹽的流動相用于檢測糖、高分子子化合物、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等幾十類化合物5、HPLC

47、前處理（1）流動相的處理溶劑的純化 選擇專供色譜分析用的“色譜純”溶劑，分析純或優(yōu)級純?nèi)軇┰诤芏嗲闆r下也可滿足色譜分析的要求。由于不同的色譜柱和檢測方法對溶劑的要求不同，有時需進行除去紫外雜質(zhì)、脫水、重蒸等純化操作。水一般采用石英系統(tǒng)二次蒸餾水。流動相脫氣 HPLC所用的流動相必須預(yù)先除去其中的空氣，習(xí)稱脫氣，一般在臨用前對流動相進行脫氣五、高效液相色譜l 超聲波振蕩脫氣、l 惰性氣體（He）鼓泡吹掃 l 抽真空l 加熱法五、高效液相色譜過濾 過濾是為了防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口處的微孔墊片，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是過濾，采用0.45

48、m以下微孔濾膜過濾。 濾膜分有機溶劑專用和水溶液專用兩種。五、高效液相色譜（2）樣品的處理 HPLC分析前需對樣品進行預(yù)處理，以便將待測物質(zhì)有效地從樣品基質(zhì)中釋放出來，使樣品的形式及所用溶劑符合HPLC的要求。待測組分的提取 根據(jù)樣品成分及組分性質(zhì)選擇合適的提取方法和提取條件。溶劑的揮發(fā) 對于液體樣品或經(jīng)處理后得到的樣品溶液，若待測物的濃度在定量限以上，且溶劑對HPLC系統(tǒng)沒有干擾，可以直接進樣分析。但很多情況下需除去溶劑，濃縮甚至干燥樣品，除去溶劑的方法有：n 自然揮散或在氮氣流下吹干，適用于小體積樣品和揮發(fā)性溶劑；n 減壓蒸發(fā)，適用于熱不穩(wěn)定樣品；n 冷凍干燥，適用于受熱易分解破壞的樣品。

49、濾過 樣品溶液進樣前，需用濾膜抽濾或針頭濾器過濾，以有效除去樣品溶液中的懸浮物或部分大分子雜質(zhì)。五、高效液相色譜（3）緩沖液的處理新鮮配置（二）HPLC系統(tǒng)適用性試驗（三）HPLC法分類及方法其中液-液分配色譜是中藥制劑分析中應(yīng)用最廣泛的方法，根據(jù)固定相與流動相的極性差別，分為正相色譜和反相色譜兩類。正相色譜:流動相極性小于固定相極性的分配色譜法，主要用于極性物質(zhì)的分離測定；反相色譜:流動相極性大于固定相極性的分配色譜法，主要用于非極性、中等極性物質(zhì)的分離測定 五、高效液相色譜化學(xué)鍵合相是將固定液的官能團鍵合在載體上所形成的固定相。 具有化學(xué)性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好，一般在pH2-8范圍的溶液中不

50、變質(zhì)，使用過程不流失，載樣量大，適于梯度洗脫等特點，已廣泛用于正相與反相色譜，離子抑制色譜，離子對色譜。 藥典中HPLC法所采用的固定相均為化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法. 五、高效液相色譜（1）反相鍵合相色譜法l反相鍵合相色譜法是現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛的方法，占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。 l反相色譜法一般采用非極性鍵合相，十八烷基鍵合相（簡稱ODS或C18）是最常用的非極性固定相，對于各種類型的化合物都有較強的適應(yīng)能力；l流動相通常以水為基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量能與水互溶的極性調(diào)整劑，常用的有甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)。 l極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其與水的混合比例對

51、溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響，l流動相的極性增大，洗脫能力降低，溶質(zhì)的k增大，tR增大；反之，k與tR減小。調(diào)整流動相的極性，可控制k值在所要求的范圍內(nèi)（k=1-10），對于結(jié)構(gòu)類似的組分，極性大的組分先出柱。 五、高效液相色譜（2）正相鍵合相色譜法 主要用于分離分析溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)。氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）鍵合相是正相色譜常用的極性鍵合相，流動相通常用烷烴（常用正已烷）加適量極性調(diào)整劑構(gòu)成。 五、高效液相色譜（3）離子對色譜法 直接將離子對試劑加入到流動相中，用以分離離子型或可離子化化合物的方法作為離子對色譜法（PIC或IPC）基本原

52、理:以C18或C8鍵合相為固定相，用含離子對試劑的有機溶媒-水溶液為流動相，用以分離離子型或可離子化化合物.適用范圍: 適用于有機酸、堿、鹽的分離;用離子交換色譜法無法分離的離子和非離子混合物的分離;在中藥制劑分析廣泛用于生物堿、有機酸的分析。缺點:離子對試劑價格比較貴.分離條件的選擇: 離子對試劑的性質(zhì)和濃度、流動相的pH值及流動相中所含有機溶劑的種類與比例等。五、高效液相色譜a/離子對試劑的選擇 通常所選用離子對試劑的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反。 離子對試劑主要應(yīng)用對象1、季銨類（如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基銨）強酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺類藥物、水溶性維生素）2、叔胺類（如三辛

53、基胺）磺酸鹽等3、烷基磺酸鹽（如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸鹽）強堿和弱堿（如兒茶酚胺、罌粟堿、煙酰胺）4、高氯酸各種堿性物質(zhì)（如有機胺、肽）5、烷基硫酸鹽（如辛烷、十二烷基硫酸鹽）應(yīng)用對象同烷基磺酸鹽五、高效液相色譜反相離子對色譜法中流動相pH值的選擇原則樣品類型流動相PH值說 明1、強酸（pKa2）如氨基酸、羧酸6-7.42-5樣品可離解，其k值取決于離子對的性質(zhì)樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質(zhì)。3、強堿（pKa8）如季銨類2-8同強酸4、弱堿（pKa8）如兒茶酚胺6-7.42-5樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質(zhì)樣品可離解，其k值取決于離子對的性質(zhì)。b/流動相pH值的控制 五、高效液相色譜c/有機溶劑的選擇 反相離子對色譜法中，甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)是最常用的流動相，流動相中所含有機溶劑的比例越高，組分的k值越小。一般而言，樣品組分的疏水性及離子對試劑的疏水性越強，所需有機溶劑的比