酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、酶動(dòng)力學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一一一堿性磷酸酶值的測(cè)定【目的要求】1. 了解底物濃度對(duì)酶促反響速度的影響2. 了解米氏方程、值的物理意義及雙倒數(shù)作圖求值的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】1、堿性磷酸酶：堿性磷酸酶是廣泛分布于人體各臟器器官中，其屮以肝臟為最多。其次為腎臟、骨骼、腸和胎盤等組織。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。本實(shí)驗(yàn)用的堿性磷酸酶是從大腸桿菌屮提取的。2、米氏方程：在研究底物濃度與酶促反響速度的定量關(guān)系時(shí)，導(dǎo)出了酶促反響動(dòng)力學(xué)的根本公式，即：V二卩機(jī)0卅S1K池十式屮：V表示酶促反響速度，也丈表示酶促反響最大速度，S表示底物濃度，心表示米氏常數(shù)。3、心值的測(cè)定主要采用圖解法，有以下四種： 雙曲線作圖法

2、圖 1-1, a根據(jù)公式1，以v對(duì)s作圖，此時(shí)1/2$人時(shí)的底物濃度s值即 為值，以克分子濃度W表示。這種方法實(shí)際上很少采用，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)條 件下的底物濃度很難使酶到達(dá)飽和。實(shí)測(cè)是一個(gè)近似值，因而1/21A不準(zhǔn)確。此外由于v對(duì)S的關(guān)系呈雙曲線，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)要求較多，且不易 繪制。 作圖法雙倒數(shù)作圖法圖 1-1, b實(shí)際工作屮，常將米氏方程式 1作數(shù)學(xué)變換，使之成為直 線形 式，測(cè)定要方便、準(zhǔn)確得多。其中之一即取 1 式的倒數(shù) , 變換為方程 式：丄=旦* 丄+亠v Vmax S Vmax2以決堆 1 作圖，即為形式。此時(shí)斜率為怦，縱截距為產(chǎn)。把直線 U U VE*VEX外推與橫軸相交，其截距相交，其

3、截距即為一亡。 作圖法略把2式等號(hào)兩邊乘以Vmax，得：輕 V+1Km*max3)以V對(duì)著作圖，這時(shí)斜率為-心，縱截距嘰,橫截距為-獸AJ作圖法(略)把(2)式等號(hào)兩邊乘以S以旦對(duì)s作圖，這時(shí)斜率為宀，縱截距為嚴(yán)。I? V mar(b)本實(shí)驗(yàn)主要以雙倒數(shù)法，即作圖法來測(cè)定堿性磷酸酶值。具體原理如下：本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其作用物， 堿性磷酸 酶能分解 磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸，在適宜條件下(10.0,和60°C),準(zhǔn)確反響13分 鐘。在堿性條件下酚可與酚試劑生成藍(lán)色 化合物，以波長620比色。在 一定條件下色澤深淺與光密度成正 比。反響式如下:9OH 霸試劑磷孵酸藍(lán)色化

4、合物然后以光密度直接表示不同底物濃度時(shí)的酶反響速度， 即以光密度的倒數(shù) 作縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)，按作圖法來 測(cè)定堿性磷酸酶值?！緝x器與試劑】儀器：1 ?恒溫水浴2. 721型分光光度計(jì)試劑：1. 酚試劑：稱鶴酸鈉"亦血吃禺。100g,鉗酸鈉血血吃弘。25g置1500磨口回流裝置內(nèi)，加蒸憎水 700, 85%磷酸50和 濃硫酸100。 充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h 燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)顆， 以防溶液溢出，再參加硫酸鋰 4150g,蒸館水50及液澳數(shù)滴。在通風(fēng)櫥中開口煮沸 15,以除 去多余的 澳。冷卻后定容至1000,過濾即成，此液應(yīng)為鮮黃 色，不帶任何綠色。 置

5、棕瓶中，可在冰箱長期保存。假設(shè)此 貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液漠，煮沸幾分 鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。使用時(shí)用 蒸憎水稀釋一倍，最 后酸度為INO2. 2. 5磷酸苯二鈉基質(zhì)液:稱取625磷酸苯二鈉C6H542? 2H20,溶于1,000容量瓶屮，加蒸餡水稀釋至刻度，加數(shù)滴夜漠以防腐，置冰箱內(nèi)可保存一年之久。3.3. 堿性磷酸酶液：稱取堿性磷酸酶1加水3、4,冰箱內(nèi)可保存 五周左右。【實(shí)驗(yàn)步驟】取6支試管按下表參加試劑1234562.5磷酸苯二鈉00.20.40.60.81.01.0蒸憾水00.80.60.40.2-0堿性緩沖液01.01.01.01.01.01.0混勻后，60&#

6、176; C欲溫5分鐘堿性磷酸酶液0.10.100.10-混勻后，60 C水浴1注意：1參加堿性磷酸 酶沼2此時(shí)為酶促犬3第六管3分鐘帥 要快速、 乏響，總體 "不加酶。亍確計(jì)時(shí)隹確。用移液槍加積2酚試劑01.01.01.01.01.01.01023()3.03.03.03.03.03.0混勻后，室濫 注意：1酚試劑為顯色劑，|5 劑后酶促反223提供堿性環(huán)境，丄放置15分鐘時(shí)為酶的變性劑，故參加酚試響即停頓。參加23后試劑才顯色以6管為調(diào)零點(diǎn)，在620波長處比色【結(jié)果處理】1將各管光密度和底物濃度記入下表管號(hào)1SI1/S123452以1為縱坐標(biāo)，l/s為橫坐標(biāo)，按作圖，求出堿性磷酸

7、酶的值【本卷須知】1) 參加堿性磷酸酶的量要準(zhǔn)確2) 保溫時(shí)間要準(zhǔn)確準(zhǔn)確保溫的方法：從第一管參加酶液開場(chǎng)計(jì)時(shí)，每隔 1 分鐘向 下一只試 管加酶液，直至加完，到準(zhǔn)確 13 分鐘立即向第一管加酚 試劑，以終止其 反響，并每隔 1 分鐘向下一只試管加酚試劑，直 至加完止，這樣保證每 管準(zhǔn)確保溫 13 分鐘?！舅伎碱}】1) 的意義及其影響因子2) 為什么酶促反響速度以初速度表示3) 為什么可直接代替 V 作圖4) 分析自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)(二)一一溫度對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私鉁囟葘?duì)酶活性及酶促反響速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)【實(shí)驗(yàn)原理】i般而每種酶都有其最適溫度，高于或低于此溫度酶的活性都降低。

8、言，假設(shè)酶處于過高的溫度環(huán)境中，會(huì)使酶活性永久喪失 ；而假設(shè)處于極低溫度的環(huán)境屮只會(huì)使酶活性受到抑制，一旦溫度，酶又會(huì)全部或局部的恢復(fù)其活性?！緝x器與試劑】儀器：1.冰箱管和試管架4.吸量管及吸量管架頭滴管7燒杯試劑：2.恒溫水浴鍋5.移液槍及槍頭3試6.膠3. 0. 03175 碘液5. 1M溶液6.稀釋100倍4. 1M溶液的唾液7.冰水浴【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 制管和預(yù)溫由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)恒溫反響要求較高，故每個(gè)溫度梯度使用兩支 試管,分別標(biāo)記為A管和B管，同時(shí)欲溫底物與酶取12支干凈試管，參照下表參加試劑：7/157 / 15管號(hào)1 (0 °)2 室溫3(37 ° C)4(50

9、9)5(70 °C)6 室溫A6.8的緩沖 液222222含的0. 5%淀粉液22222用2的蒸 憾水代替B稀釋100倍的唾液111111*6號(hào)管為對(duì)照組比色時(shí)作為 0號(hào)管，置于室溫，且淀粉液用蒸憎水代替2. 混合A、B管將1號(hào)A管試劑迅速參加溫度對(duì)應(yīng)的 B管中為了最大限度 保證 酶的量，此時(shí)為計(jì)時(shí)的起點(diǎn)使用秒表，搖勻后放回對(duì)應(yīng) 溫度繼續(xù) 水浴。注意：轉(zhuǎn)移A管試劑前需將其搖勻。3. 時(shí)間控制然后每隔1或2時(shí)間自定按上步操作依次把 2、3、4、5、6號(hào)的A、B管混合，嚴(yán)格控制好時(shí)間。4. 中止反響準(zhǔn)確反響13,向1號(hào)管參加2滴1M溶液，立即混勻，屮止 反響, 按上一步的順序和時(shí)間間隔依

10、次對(duì)各管進(jìn)展操作，并移至 試管架。后再 各用2滴1M溶液屮和每管。5. 顯色在每管中各參加2 0.03175碘液并混勻，觀察現(xiàn)象6. 比色假設(shè)不同溫度梯度間現(xiàn)象差異不明顯，那么進(jìn)展比色，通過光密度值來比較。【結(jié)果處理】 記錄現(xiàn)象或比較吸光度值，做出合理分析。【本卷須知】嚴(yán)格注意時(shí)間的控制及各物質(zhì)的添加量。【思考題】 如果某同學(xué)沒有嚴(yán)格按照教案步驟做出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為唾液淀 粉酶的 最適溫度為 70 度，請(qǐng)分析他得出這樣的結(jié)果的可能原因。實(shí)驗(yàn)三對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解對(duì)酶活性及酶促反響速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)原理】1 對(duì)酶活性影響的機(jī)理：影響酶活性中心的某些必須基團(tuán)的解離，而這

11、些基團(tuán)往往僅在某一解離狀態(tài)時(shí)才最容易同底物結(jié)合或 具有最大催化 活性；影響可解離基團(tuán)的底物和輔酶的荷電狀態(tài)， 從而影響酶對(duì)他們的 親和力；還可以影響酶活性屮心的空間構(gòu)象 , 從而影響酶的活性。2. 本實(shí)驗(yàn)用唾液淀粉酶為材料來觀察酶活性受的影響的情況。 淀粉 在該酶的催化作用下會(huì)隨著時(shí)間的延長而出現(xiàn)不同程度的 水解，從而得 到各種糊精乃至麥芽糖，少量葡萄糖等水解產(chǎn)物。碘 液與淀粉及其不同 程度的水解產(chǎn)物反響呈現(xiàn)不同顏色，即淀粉9 / 159 / 15 藍(lán)色、紫色糊精紫色、紅色糊精紅色、麥芽糖及少量葡萄 糖 黃色?！緝x器與試劑】儀器：1、冰箱2、電爐3、恒溫水浴鍋4、試管架及試管5、移液管架及移液

12、管試劑：1、 0. 2M磷酸氫二鈉溶液：稱取35. 61g含2個(gè)結(jié)晶水的磷酸 氫二 鈉，用水定容至 1L。2、 0. 1M檸檬酸溶液：稱取21.01g含一個(gè)結(jié)晶水的檸檬酸，用水定 容至 lLo3、唾液淀粉酶：將唾液分別稀釋 10 倍、 50 倍和 100 倍，得 三種不 同濃度的酶液、5、0.1%淀粉液：0. lg可溶性淀粉，加到100蒸憾水中，加 熱溶解。6、碘液： 15g 碘化鉀和 12. 7g 碘，加少許水使碘完全溶解后 , 再用水稀釋至 200。7、1%氯化鈉溶液。8、0. 1%硫酸銅溶液?！緦?shí)驗(yàn)步驟】一對(duì)酶活性的影響表1磷酸1編號(hào)和加試劑：2操作:1、緩沖溶液的配制配制取六只干凈的三

13、角燒瓶，按表 取六支干凈試管，編號(hào)后按表三角燒瓶號(hào)123456值5.46.26.87.07.48.00.2M磷酸二氫鈉 011.1513.2215.4516.4718.1719.450.1 M檸檬酸08.856.784.553.531.830.55表2對(duì)酶活性的影響管號(hào)123456值5.46.26.87.07.48.0緩沖液量333333含的0.5%淀粉0222222稀釋100倍唾液0222222充分搖勻，37° C水浴保溫，嚴(yán)格控制時(shí)間5后，立即向各管參加碘液碘液滴333333充分搖勻，觀察各管顏色差異【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象或比較吸光度值，做出合理分析【本卷須知】 充分搖勻，嚴(yán)格控制

14、時(shí)間思考題】酶的最適值受哪些因素影響 ?實(shí)驗(yàn)四一一酶濃度對(duì)酶活性的影響的認(rèn)識(shí)。速度隨而且酶的同一適【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解酶濃度對(duì)酶活性及酶促反響速度的影響，加深對(duì)酶特性【實(shí)驗(yàn)原理】在適宜的條件下，假設(shè)反響物濃度大大高于酶濃度時(shí)，反響 酶濃度增加而增加，兩者間成正比。但假設(shè)反響底物濃度 較低 濃度足夠高時(shí)，增加酶濃度，反響速度根本不變。本實(shí)驗(yàn)采用唾液淀粉酶為例。參加不同濃度的酶，并比較在 當(dāng)時(shí)間后，以碘檢驗(yàn)淀粉的含量從而確認(rèn)其反響程度。【儀器與試劑】儀器：1 ? 恒溫水浴鍋2. 吸量管3. 試管與試管架試劑：1. 含的 0.5%淀粉液2.7. 0的緩沖液3.分別稀釋過10倍、50倍和100倍后的唾液

15、【實(shí)驗(yàn)步驟】1.取3支干凈試管，按下表參加淀粉液，緩沖液，加畢放入37度恒溫水浴鍋屮保溫5分鐘；2.保溫后，快速參加不同濃度的稀釋唾液，搖勻，立即放入37度恒溫水浴屮，并計(jì)時(shí)。約 3至4分鐘后參加等量碘液一至 兩滴，立 即搖勻后，記錄各管的顏色。管號(hào)含的0.5%淀粉液7.0的緩沖液稀釋唾液顏色10倍50倍100倍132123213321【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象，做出合理分析【思考題】實(shí)驗(yàn)五離子對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私怆x子對(duì)酶活性及酶促反響速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)【實(shí)驗(yàn)原理】酶的活性常常受某些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能使酶的活性增 加，稱 為酶的激活劑；有些物質(zhì)能使酶的活性降低，稱為酶的抑 制劑。是唾液淀 粉酶的激活劑。其它的陰離子，女口、和對(duì)該酶 也有激活作用，但較微 弱。而貉對(duì)唾液淀粉酶具有抑制作用。激 活劑和抑制劑影響酶活性的劑量 是很少的，并且常具有特異性。就本實(shí)驗(yàn)，低濃度可以增加酶活性，高濃度的或者低濃度的 那么會(huì) 抑制酶活性，同時(shí)低濃度的、產(chǎn)等對(duì)酶活性沒有影響。 激活劑的作用機(jī)制是多種多樣的， 可能是作為輔酶或輔基的一個(gè) 組成局部， 也可以直接作為酶活性屮心