Western Blot免疫足跡

1、 Western印跡法這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對(duì)特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測(cè)之。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定。 所有電泳的試劑，包括上樣buffer，SDS-PAGE配膠試劑盒，電泳buffer、蛋白Marker和蛋白染色試劑盒。第一步：根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度進(jìn)行凝膠的配制，可以使用SDSPAGE凝膠配制試劑盒。第二步：進(jìn)行蛋白變性，樣品先置95的水浴加熱5分鐘，接著置冰浴中5分鐘，10

2、000g離心20分鐘，取上清液（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）。蛋白上樣緩沖液可以使用5SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。第三步依次加入預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和待分析樣品?；静僮髁鞒蹋禾崛〖?xì)胞或組織蛋白、測(cè)定大致含量制備SDS-PAGE膠蛋白樣品變性、電泳電泳轉(zhuǎn)膜封閉（2小時(shí)）一抗(4度過(guò)夜) TBST洗滌（洗4遍）HRP標(biāo)記的二抗（1.5小時(shí)）TBST洗滌（洗四遍）ECL試劑作用X-光片曝光、顯影結(jié)果分析詳細(xì)操作流程1.試劑1.1 .SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液1.2 SDS-PAGE凝膠配制1M Tris-HCl （pH6.8）:稱取24.23g Tris，加dd H2

3、O充分溶解，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至6.8（約14ml），定容至200ml，121oC 20min滅菌，室溫保存。1M Tris-HCl （pH8.0）:稱取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0（約8.4ml），定容至200ml，12120min滅菌，室溫保存。1.5M Tris-HCl （pH8.8）:稱取36.34g Tris，加dd H2O充分溶解，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至8.8（約5ml），定容至200ml，12120min滅菌，室溫保存。10%（W/V）SDS:稱取50gSDS，加400ml dd H2O，68加熱溶解。滴加濃HCl調(diào)節(jié)pH值至7.

4、2，定容至500ml，室溫保存。30%（W/V）Acrylamide:稱取29g Acrylamide，1g N，N-至甲雙丙烯酰胺（BIS），加dd H2O溶解，定容至100ml，用0.45m濾膜濾去雜質(zhì)，4避光保存。20xPBS：稱取Na2HPO4 11.5g，KH2PO4 2g，KCL 2g ,NaCl 80g，定溶至500ml蒸餾水中。10%（W/V）過(guò)硫酸銨:稱取1g過(guò)硫酸銨，加10ml dd H2O 充分溶解，4保存（有效期約為兩周）,分裝于1.5的離心管中，每管1mL，-20度長(zhǎng)期保存。1.3 SDS-PAGE電泳液10Tris-Glycine Buffer （SDS-PAGE電

5、泳緩沖液）:稱取15.1g Tris，94g Glycine，5gSDS，加ddH2O 充分溶解，定容至500L，室溫保存。注：Tris和Glycine難溶，可70度水浴加熱，并攪拌，室溫保存。SDS溶解易起氣泡，常用50mL 10%的SDS代替固體配制。1Tris-Glycine Buffer （SDS-PAGE電泳緩沖液）:量取50ml 10Tris-Glycine Buffer，定溶至500mL，混勻，室溫保存。1.4 NC膜（硝酸纖維素膜）或PVDF膜1.5 Western轉(zhuǎn)膜液10X電轉(zhuǎn)液：稱取2.9g Glycine，5.8g Tris，0.37g SDS，加ddH2O 充分溶解，

6、定容至500ml，混勻，室溫保存。1X電轉(zhuǎn)液：25mL 10X電轉(zhuǎn)液，加100mL的甲醇，混勻，室溫保存。1.6 洗滌液PBST Buffer:量取25ml 20PBS，0.25ml Tween 20，加dd H2O定容至500mL，混勻，室溫保存。1.7 封閉液稱取1.25g脫脂奶粉，加入25ml TBST Buffer中，充分溶解，4 oC保存。1.8 一抗（可重復(fù)使用，置于4度冰箱）PBST 1mL 加一抗1ug ,配成1ug/mL,4度冰箱過(guò)夜。次日，PBST洗膜4次。二抗 （1:5000）5%的奶粉：取0.25g奶粉，加5mLPBST,加1ug的二抗，于50mL大離心管，室溫，1.5

7、小時(shí)。之后，PBST洗4次。1.9 EasySee Western Blot Kit1.10 預(yù)染marker1.11 BCA蛋白定量試劑盒2. 蛋白樣品制備2.1蛋白粗提在人體中IgG占總抗體80%，成人血清中含量為12.5%/ml左右，IgG粗純一般用飽和(NH4)2SO4(SAS)進(jìn)行，一般操作如下：1）8ml血清中加入8ml PBS（0.02 PH7.0），混勻后滴加4ml SAS,使其終濃度為20%（目的是除去纖維蛋白原）。2）4，1h后7000rpm離心10min。3）留上清，補(bǔ)加12ml SAS，邊振蕩另滴加。（終濃度為50%，可除去AIb）4）4，1h后，7000rmp離心10

8、min。5）留沉淀溶于10ml PBS中，滴加5ml SAS，然后4，1h后，7000rmp離心10min。6）棄上清，沉淀溶于10ml PBS，滴加5ml SAS。7） 5）至6）重復(fù)三次8）棄上清，沉淀溶于4ml PBS中，PBS透析過(guò)夜（400ml）結(jié)果：整個(gè)實(shí)驗(yàn)需7h，注意在離心前離心機(jī)應(yīng)降溫。粗提的IgG抗體免疫反應(yīng)可達(dá)到70%-80%。此濃度只針對(duì)IgG抗體，若分子量不同使用SAS濃度也不同。操作中應(yīng)盡量讓蛋白少起泡，防止變性減少蛋白損失。2.2 試劑盒提?。≧IPA lysis buffer為例2.2.1 對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：1）融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前

9、數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。2）對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。 對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管，然后再裂解。3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可

10、進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。裂解液用量說(shuō)明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。2.2.2 對(duì)于組織樣品：1）把組織剪切成細(xì)小的碎片。2）融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。3）按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。4）用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。5）充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，

11、取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。6）如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。 注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見(jiàn)

12、的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。 3 蛋白樣品的初步定量（詳細(xì)步驟見(jiàn)BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)） 蛋白質(zhì)定量的方法比較多，目前用得比較多的是 BCA 法，其基本原理為要分析的蛋白在堿性溶液里與 Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生 Cu+，后者與 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強(qiáng)，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以確定對(duì)應(yīng)樣品的蛋白濃度，具體的操作步驟可以參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。Western Blot 的對(duì)蛋白濃度的檢測(cè)要求通常1ug/ul，大部分培養(yǎng)的細(xì)胞或者組織都是可以滿足的，注意因?yàn)闇y(cè)

13、定的是總蛋白濃度，而非特異性蛋白的量，有時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)測(cè)量總蛋白含量很高，做WB時(shí)卻求檢測(cè)到目的蛋白條帶，就是因?yàn)樘禺愋缘鞍踪|(zhì)表達(dá)很低。所以這步只具有參考意義。在后面的檢測(cè)中，都平行做內(nèi)參的檢測(cè)，以確定電泳系統(tǒng)的質(zhì)控。 4 SDS-PAGE電泳 （1）清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗滌靈輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在架子上晾干后，保證玻璃板上無(wú)污性方可使用。 （2）灌膠與上樣 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠，整個(gè)操作應(yīng)輕柔，夾子平行按下，以免玻璃板破碎） 制備分離膠（pH 8.8）（試劑配方詳見(jiàn)最后

14、附表）3. 灌膠時(shí)，可用1ml槍吸取1ml膠沿玻璃放出，溶液緩慢加入到裝配好的板中至凝膠高度為6 cm左右，預(yù)留1.5 cm高度配制濃縮膠。然后膠上加一層水，液封后的膠凝得更快。（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）室溫放置0.51小時(shí)左右至聚合完全。 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干（注意吸水紙不可觸及分離膠）。 制備濃縮膠（PH6.8）：將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)

15、生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。凝膠聚合約0.51小時(shí)左右。 將其放入電泳槽中，可用200ul槍吸取電泳液將膠里的各個(gè)孔輕輕吹吸幾下，可將孔內(nèi)氣泡及碎膠趕出。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊WB專用玻璃板） 取提取好的蛋白，約1015ul與5SDS上樣緩沖液按5：1的比例混合，加到1.5ml離心管中，然后沸水中煮35min使蛋白完全變性。 電泳：電泳的電壓為100V較好，也可用120150V。電泳至溴酚蘭剛

16、跑出即可終止電泳，時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)檢測(cè)蛋白質(zhì)大小確定，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。注意：1）10%APS需現(xiàn)用現(xiàn)配，或配好分裝后放入-20度以下凍存，一般4度保存的APS使用時(shí)間最好不好超過(guò)一個(gè)星期。否則易造成膠不凝。2）丙烯酰胺、TEMED均為毒性物質(zhì)，使用時(shí)嚴(yán)禁與皮膚接觸。3）配制Tris-Cl時(shí)，嚴(yán)格控制好其PH值，這對(duì)于蛋白分離至關(guān)重要。5 轉(zhuǎn)膜 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作 1）、制備足夠轉(zhuǎn)移緩沖液以充滿轉(zhuǎn)移槽，另外準(zhǔn)備200 ml用于平衡凝膠和膜以及潤(rùn)濕濾紙。 2）、從玻璃板上取下凝膠，去除所有濃縮膠。 3）、將凝膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中15-30分鐘。 4）、濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)移緩沖液中至少浸泡30秒。 5）、準(zhǔn)備膜： a、

17、硝酸纖維素膜：將膜進(jìn)入轉(zhuǎn)移緩沖液中15-30分鐘 b、PVDF膜（PVDF膜具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度以及具有更好的化學(xué)兼容性，根據(jù)目的蛋白大小選擇膜孔徑大小，有0.45um和0.22um）在甲醇中潤(rùn)濕膜15秒，保證膜由不透明變成半透明。 小心將膜放入雙蒸水水中浸泡 2 分鐘。 小心將膜放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡至少 5 分鐘。 將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒單個(gè)方向（來(lái)回趕容易使膠破裂）趕幾遍以趕走里面的氣泡（一手趕另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)）。在墊子上墊三層濾紙（可邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套， 實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門(mén)以使空氣流通

18、。） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破，同時(shí)在膠的右上角做個(gè)記號(hào)。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的紅面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。轉(zhuǎn)膜裝置置于冰水中，打開(kāi)電源30 mA過(guò)夜或200mA 2小時(shí)。 轉(zhuǎn)完后在膜上做個(gè)記號(hào)，以判斷膜的正反面，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，若看見(jiàn)預(yù)染Marker條帶，說(shuō)明轉(zhuǎn)膜成功。6免疫反應(yīng) （1）將膜用TBST從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下,用封閉液在脫色搖床上搖動(dòng)封閉2h或者度過(guò)夜，如果預(yù)實(shí)驗(yàn)做完后，發(fā)現(xiàn)背景比較高，可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間（2）將一抗用封閉液稀釋液（如回收，請(qǐng)用專用稀釋液稀釋）稀釋至適當(dāng)濃度；通常用自封袋裝溶液（在平皿中反應(yīng)也可以），溶液體積大概1-5ml，從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后（不必洗滌），將膜蛋白面朝上放于抗體液面上，脫色搖床上37孵育3h 后，用TBS