細胞增殖與凋亡在牙齒發(fā)育中的作用

1、    細胞增殖與凋亡在牙齒發(fā)育中的作用趙書芳金巖李松趙皿楊憲剛摘要目的:闡明細胞增殖與凋亡在牙齒發(fā)生、發(fā)育過程中的機制，探討牙齒發(fā)育的機理。方法:選用純系SD大鼠建立牙齒發(fā)育模型，采用原位末端標記法（TUNEL法）及免疫組織化學增殖細胞核抗原（PCNA）染色技術(shù)，觀察分析純系SD大鼠牙胚發(fā)育不同階段細胞增殖及凋亡情況。結(jié)果:在牙齒發(fā)育的蕾狀期、帽狀期、鐘狀期增殖及凋亡的陽性細胞均出現(xiàn)在細胞增殖生長中心處。鐘狀晚期及牙體組織形成后，已分化的外釉上皮細胞、成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞中也可見，但以牙乳頭及星網(wǎng)層細胞中多見。結(jié)論:牙齒發(fā)育過程中的細胞增殖與凋亡同時

2、出現(xiàn)在生長中心部位，說明二者在牙齒發(fā)育中相互協(xié)調(diào)，共同控制牙齒的形態(tài)形成。關(guān)鍵詞增殖細胞核抗原細胞凋亡發(fā)育原位末端標記法Cell Proliferation and Programmed Cell Death in Tooth DevelopmentZhao Shufang, Jin Yan, Li Song, et alCollege of Stomatology, the Fourth Military Medical UniversityYang XiangangJilin Employee Medical UniversityAbstractObjective: To evaluate

3、 the role of cell proliferation and programmed cell death (PCD) in the tooth development by detecting programmed cell death and expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Methods: Expression of PCNA and PCD were detected by immunohistochemical staining and Tdt-mediated dUTP nick end la

4、belling (TUNEL) in different stages of the tooth development of Sprague-Dawly rats. Results: The positive cells of PCNA and PCD predominantly appeared at the prolife-rating growth center in the bud, the cap and the earlier bell stages of tooth development. PCNA and PCD were also observed in amelobla

5、sts and odontoblasts, especially in the stellate reticulum cells of enamel organ and dental papilla during the period of dentin formation. Conclusion: Cell proliferation and programmed cell death are interrelated and interact on each other in the development of teeth, and they both involve in sculpt

6、uring the shape of teeth.Key words:proliferating cell nuclear antigenprogrammed cell deathdevelopmentTdt-mediated dUTP nick end labelling人體從胚胎開始到發(fā)育成熟不只是細胞增殖的過程。近年的許多研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡(apoptosis）又稱為程序性細胞死亡（programmed cell death，簡稱PCD）在機體的胚胎發(fā)育、器官形成過程中發(fā)揮著重要的作用13。如果這對矛盾不能協(xié)調(diào)進行，將可能發(fā)生畸形甚至導致腫瘤的發(fā)生。關(guān)于這點在腫瘤方面已有許多研究，但在發(fā)育

7、中尤其是牙齒發(fā)育所知甚少2,3。因此，本實驗擬采用原位末端標記法（TUNEL法）及增殖細胞核抗原免疫組化技術(shù)較系統(tǒng)地觀察和分析SD大鼠牙齒發(fā)育過程中的細胞增殖和凋亡的作用，以期揭示牙齒發(fā)育的機理。1材料和方法1.1動物模型建立選用純系SD（Sprape Dawley, SD）大鼠20只，3月齡，體重220250 g，上海實驗動物中心提供。每日隨機按41雌雄比例同籠，次日早800觀察雌鼠陰栓情況，有陰栓者為妊娠0天,標記后隔離飼養(yǎng)，記錄生長情況。1.2標本制備取妊娠SD雌鼠分別于胚胎13、15、17、19天及生后1、3、5、7天宰殺，剖腹取其胎鼠頭部，固定在4多聚甲醛溶液中，系列酒精脫水，石臘定

8、向包埋，行冠狀和矢狀面5 m切片。1.3免疫組織化學檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,簡稱PCNA)免疫組織化學染色采用ABC法，石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶及枸櫞酸緩沖液微波修復抗原10分后，用正常羊血清封閉30分;加PCNA單抗（鼠抗大鼠，美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)置于 4過夜，室溫下復溫1小時后滴加生物素化二抗37反應(yīng)30分;再加ABC復合物37孵育30分,二氨基聯(lián)苯氨(DAB）顯色后，二甲苯透明,封片。14原位末端標記法（TUNEL法）標記PCD細胞TUNEL（Tdt-mediated dUTP

9、nick end labelling）法（試劑盒購自美國 Oncor公司）：切片常規(guī)脫蠟至水，室溫下20 mgL的蛋白酶K消化15分；3H2O2的PBS溶液中處理5分后，加5 l的平衡液（TUNEL試劑盒原配）1分；再加含TDT酶反應(yīng)液15 l，37反應(yīng)l5小時后用預(yù)熱的中止反應(yīng)液中止反應(yīng)（TUNEL試劑盒原配）；緩沖液1漂洗2次(15 min/次）后加2的正常羊血清孵育30分;滴加抗地高辛堿性磷酸酶抗體置于濕盒中孵育2小時;經(jīng)緩沖液1、緩沖液3漂洗后，加新配制的顯色液5-溴-4-氯-3-吲哚鹽加硝基藍四唑鹽(NBT加BCIP)顯色系統(tǒng)，用緩沖液3配制，NBT4.5 l、BCIP 3.5 l、

10、0.24 mg/ml左旋咪唑20 l，暗處顯色。中止顯色后，梯度酒精脫水，二甲苯透明封片。2結(jié)果2.lPCNA免疫組化觀察胚胎13天蕾狀期,PCNA陽性細胞集中在蕾狀突起中央部分，周圍的上皮細胞及間充質(zhì)細胞增生活躍，也散在可見陽性細胞（圖l）。胚胎15天帽狀期，細胞增生活躍，成釉器及牙乳頭和牙囊已形成。PCNA陽性細胞主要集中在內(nèi)釉上皮中心區(qū)域（原發(fā)性釉結(jié)節(jié)）及內(nèi)外釉上皮細胞增殖形成頸環(huán)處，牙乳頭中的間充質(zhì)細胞中散在（圖2）。胚胎17天鐘狀早期及19天鐘狀期，PCNA陽性細胞主要集中在成釉器的未來牙尖形成部位（繼發(fā)性釉結(jié)節(jié)）及頸環(huán)處,間充質(zhì)細胞中散在可見（圖3）。出生后，牙本質(zhì)牙釉質(zhì)基質(zhì)均已開

11、始形成，成釉器逐漸退化，PCNA陽性細胞在星網(wǎng)層細胞多見，間充質(zhì)細胞散在可見。隨著牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)基質(zhì)逐漸分泌增加，成釉器不斷退化，PCNA陽性細胞在成釉器的成釉細胞及成牙本質(zhì)、間充質(zhì)細胞中可見，其余部位逐漸少見。 圖1蕾狀期PCD陽性細胞散在于上皮細胞形成的蕾狀突起中央?yún)^(qū)及頭部NBT+BCIP×200 圖2帽狀期PCD陽性細胞集中出現(xiàn)在以內(nèi)釉上皮中心為主的區(qū)域NBT+BCIP×132 圖3帽狀期PCD陽性細胞出現(xiàn)在頸環(huán)和鄰近頸環(huán)的周圍間充質(zhì)細胞中NBT+BCIP×1322.2TUNEL法觀察胚胎13天,口腔上皮細胞增生內(nèi)陷呈蕾狀突起，

12、PCD陽性細胞集中在上皮細胞形成的蕾狀頭部，鄰近間充質(zhì)細胞增生活躍，偶見PCD陽性細胞（圖4）。胚胎15天帽狀期,細胞增生活躍，成釉器及牙乳頭和牙囊已形成。PCD陽性細胞主要集中在內(nèi)釉上皮中心區(qū)域（原發(fā)性釉結(jié)節(jié)）及內(nèi)外釉上皮細胞增殖形成頸環(huán)處，其中已分化的內(nèi)釉上皮細胞約占30，星網(wǎng)層細胞約40，牙乳頭中的間充質(zhì)細胞約占30%，余者偶見（圖5）。胚胎17天鐘狀早期,PCD陽性細胞明顯增多，主要集中在成釉器的未來牙尖形成部位（繼發(fā)性釉結(jié)節(jié)）及頸環(huán)處，內(nèi)釉上皮細胞中約40，其鄰接的星網(wǎng)層細胞約30,間充質(zhì)細胞約25，其余部位散在（圖6）。胚胎19天鐘狀期，成牙本質(zhì)細胞已分化，開始分泌牙本質(zhì)基質(zhì)，在成

13、牙本質(zhì)細胞中PCD陽性細胞約有20，在成釉器的星網(wǎng)層細胞約占30，牙乳頭中的間充質(zhì)細胞約占20，其它部位散在。生后1天牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)基質(zhì)均已開始形成，成釉器逐漸退化，PCD陽性細胞在星網(wǎng)層細胞多見約30%，間充質(zhì)細胞約20%，其余偶見。生后3天牙體組織形成期，牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)基質(zhì)逐漸分泌增加，成釉器不斷退化，PCD陽性細胞在成釉器的星網(wǎng)層細胞約25，間充質(zhì)細胞約15，其余部位少見。生后5天牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)基質(zhì)進一步鈣化形成,成釉器進一步退化，PCD陽性細胞逐漸較少。生后7天隨著基質(zhì)鈣化形成，牙胚各部分細胞成分明顯減少，PCD陽性細胞也少見。  圖4蕾狀突起頭部及周圍間充質(zhì)細胞中PCNA陽

14、性細胞廣泛分布NBT+BCIP×132 圖5帽狀期PCNA陽性細胞集中分布于頸環(huán)周圍×200 圖6牙體組織形成期PCNA陽性細胞集中出現(xiàn)在成牙本質(zhì)細胞層×2003討論發(fā)生于發(fā)育過程中的細胞凋亡是一些生物性因子或激素通過細胞膜或細胞內(nèi)受體介導的細胞自然死亡現(xiàn)象。多用于揭示在胚胎發(fā)育、個體成熟等復雜的生理及病理過程中，在特定的時間、空間所發(fā)生的一種主動接受基因調(diào)控的程序性細胞死亡。目前已知細胞凋亡在組織、器官發(fā)育形成過程中具有組織塑形，消除不必要結(jié)構(gòu)，控制細胞數(shù)量，清除多余、衰老、異常的細胞的作用。因此，本研究采用細胞凋亡特異性原位末端標記法，可以

15、特異顯示細胞凋亡在牙齒發(fā)育過程中的變化規(guī)律4,5。PCNA是一種DNA多聚酶的輔助因子，是細胞增殖分裂所必須的成分之一，是一種只出現(xiàn)在細胞增殖狀態(tài)細胞核內(nèi)的酸性蛋白質(zhì)。它在細胞增生分裂的S期達到高峰，因此，PCNA陽性著色細胞主要反映處于S期增殖狀態(tài)的細胞。本實驗通過免疫組化染色觀察不同時期牙齒發(fā)育過程中PCNA的情況，揭示PCNA與細胞凋亡在牙齒發(fā)育中的關(guān)系。結(jié)果表明:在牙胚發(fā)育的蕾狀期，蕾狀突起頭部的星形細胞及周圍上皮細胞、間充質(zhì)細胞中PCNA陽性細胞廣泛分布，這時PCD活躍在生長中心蕾狀突起的頭部，說明從牙蕾開始形成到蕾狀期發(fā)育完成，上皮細胞增殖極其活躍，此時的PCD調(diào)控著細胞增殖數(shù)量，

16、可能是上皮性成釉器不斷向下生長的需要，也可能是牙蕾形態(tài)形成所必需的一種主動塑形現(xiàn)象。帽狀期PCNA陽性細胞主要集中在內(nèi)釉上皮中心區(qū)域（原發(fā)性釉結(jié)節(jié)）及內(nèi)外釉上皮細胞增殖形成頸環(huán)處，此時，PCD也出現(xiàn)在帽狀成釉器中以內(nèi)釉上皮為中心的生長中心（原發(fā)性釉結(jié)節(jié)、頸環(huán)）處，提示原發(fā)性釉結(jié)節(jié)及頸環(huán)是牙齒發(fā)育的中心。這些部位通過上皮間充質(zhì)相互誘導作用，細胞不斷分裂、增殖的同時PCD在調(diào)控著細胞的增殖和分化，調(diào)控著牙尖、牙頸、牙根部的形成。使牙胚得以不斷發(fā)育及塑形。這可能是牙胚不斷向外生長擴大及不斷塑形的需要。牙齒發(fā)育進入鐘狀期，PCNA及PCD陽性細胞集中在成釉器未來牙尖形成部位（繼發(fā)性釉結(jié)節(jié)）及頸環(huán)處，說

17、明繼發(fā)性釉結(jié)節(jié)是鐘狀期的牙齒生長中心。已有研究表明繼發(fā)性釉結(jié)節(jié)是控制牙尖形成的信號中心，此期同樣通過PCNA的表達及PCD出現(xiàn)發(fā)揮著調(diào)控牙齒發(fā)育及塑形。進入牙體組織形成期隨著成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞的分化成熟，牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)基質(zhì)的分泌形成，成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞及星網(wǎng)層、牙乳頭細胞均有PCNA的表達及PCD陽性細胞，說明成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞增殖旺盛分泌基質(zhì)的同時，通過PCD清除已經(jīng)結(jié)束生命周期的、衰老的、多余的上皮及間充質(zhì)細胞，控制著細胞數(shù)量，消除繼發(fā)性釉結(jié)節(jié)、星網(wǎng)層等暫時性結(jié)構(gòu)?？梢?，在牙齒發(fā)育過程中，PCNA和PCD相互協(xié)調(diào)作用，及時調(diào)控著細胞的增殖和分化，及時清除異常、衰老的細胞，在牙齒

18、形態(tài)形成過程中，發(fā)揮重要的塑形作用。由此得知：牙齒胚胎發(fā)育過程中PCNA和PCD有著密切的關(guān)系，它們都集中出現(xiàn)在生長中心的細胞中，由于生長中心的細胞多處于增殖期，在細胞增殖旺盛的同時，通過細胞凋亡可清除過多增殖的細胞，控制著細胞的數(shù)量；也及時消除異常、衰老的細胞及暫時性結(jié)構(gòu)，即在細胞增殖高峰之后是細胞凋亡高峰，二者在牙齒形態(tài)形成過程中，相互協(xié)調(diào)、互相制約共同發(fā)揮著重要的塑形作用。作者單位：趙書芳金巖李松趙皿第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院710032楊憲剛吉林職工醫(yī)科大學參考文獻1Michael D， Weil JM, Raff MC Programmed cell death in animal development Cell, 1997，88:3473542Sanders EJ, Wride MA Programmed cell death in development. Int Rev Cytol, l995，163：10