小麥貯藏蛋白反相高效液相色譜分析體系研究

1、小麥貯藏蛋白反相高效液相色譜分析體系研究張平平1.2，張 勇2，夏先春2，何中虎2.3（1華中農(nóng)業(yè)大學植物科技學院，武漢430007；2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/國家小麥改良中心/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學工程，北京100081；3國際玉米小麥改良中心中國辦事處，北京100081）摘要：【目的】反相高效液相色譜（RP-HPLC）是定性和定量分析小麥貯藏蛋白的有效方法，在國外的應用始于20世紀80年代初，但在國內(nèi)一直沒有利用，也無開展系統(tǒng)的研究。本研究的目的是填補國內(nèi)這一研究的空白?！痉椒ā窟x用2個代表性品種中優(yōu)9507（強筋）和京411（弱筋），系統(tǒng)研究了柱溫、洗脫梯度、樣品量、

2、提取時間和進樣體積對貯藏蛋白分離效果和量化的影響，并驗證了分析重復性?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，45 mg面粉樣品，使用50%正丙醇（v/v）和含有50%正丙醇（v/v）、1%二硫蘇糖醇（w/v）的弱酸緩沖液（Tris-HCl，pH6.6），分別對醇溶蛋白和谷蛋白提取45 min，可以使提取率達到90%。醇溶蛋白和谷蛋白分別進樣1015 µl和1520 µl，可以使實際量化值接近理論量化值。針對我國小麥品種貯藏蛋白組成的特殊性對洗脫梯度進行優(yōu)化后，提高了高分子量谷蛋白亞基與低分子量谷蛋白亞基之間的分離度?！窘Y(jié)論】配合聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）可以對貯藏蛋白各組分進行準確定性定量

3、分析，為深入研究小麥貯藏蛋白和加工品質(zhì)的關(guān)系提供了工具。關(guān)鍵詞：小麥；貯藏蛋白；高效液相色譜；定性和定量分析Protocol Establishment of Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) for Analyzing Wheat Gluten ProteinZHANG Ping-ping1,2, ZHANG Yong2, XIA Xian-chun2, HE Zhong-hu2,3(1College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricul

4、tural University, Wuhan 430070; 2Institute of Crop Science / National Wheat Improvement Center/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 3CIMMYT China Office, Beijing 100081)Abstract: 【Objective】This study will es

5、tablish a protocol of reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) used in separating and quantifying wheat gluten protein in China, which has been widely used in wheat quality study since the 1980s. 【Method】Two cultivars, Zhongyou 9507 (strong gluten) and Jing 411 (weak gluten),

6、were chosen to study the effect of temperature, elution gradient, sample weight, extraction duration, and injection volume on gluten protein resolution. The ability to repeat experimental results was validated. 【Result】The results indicated that the gliadin and glutenin subunits extraction rate reac

7、hed 90% when 45mg of flour was extracted with 1 ml 50% aqueous 1-propanol (v/v) and glutenin extraction buffer (50% 1-propanal (v/v) +2 mol·L-1 Urea+0.2 mol·L-1 Tris-HCl (pH 6.6)+1%DTT), respectively. The optimal sample injection volume of gliadin and glutenin was 10-15 µl and 15-20 &

8、#181;l, respectively. The modified elution gradient effectively separated gliadin and glutenin subunits. 【Conclusion】This protocol can qualify and quantify the components of gliadin and glutenin accurately combining SDS-PAGE, by which we can predicate the wheat end-use quality.Key words: Wheat (T. a

9、estivum L.); Gluten protein; High-performance liquid chromatography; Qualitative and quantitative analyses0 引言【研究意義】貯藏蛋白占小麥籽粒重量的8%20%，由谷蛋白和醇溶蛋白組成，二者共同決定了面團的粘彈性。根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）遷移率，麥谷蛋白可分為高分子量亞基（HMW-GS）和低分子量亞基（LMW-GS）?！厩叭搜芯窟M展】大量研究表明，麥谷蛋白亞基組成及其表達量和麥谷蛋白與醇溶蛋白的比例對于小麥加工品質(zhì)具有重要作用1。高分子量麥谷蛋白亞基含量與

10、面團形成時間、最大抗延阻力和面包體積呈高度正相關(guān)，其中x型亞基與面包體積的正相關(guān)關(guān)系（r0.78）比y型亞基更顯著，并以5和7亞基的貢獻最大2,3。Uthayakumaram等4認為，保持蛋白質(zhì)含量不變，增加麥谷蛋白/醇溶蛋白的比例將增加面團形成時間、最大抗延阻力和面包體積。定性和定量分析麥谷蛋白亞基和醇溶蛋白是研究小麥加工品質(zhì)的重要內(nèi)容2,5,6?！颈狙芯壳腥朦c】常用的蛋白質(zhì)組分定性定量分析方法包括聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、雙向凝膠電泳（2-DE）、色譜法（chromatography）以及新近的高效毛細管電泳（HPCE）7等。PAGE是傳統(tǒng)的定性分析方法，結(jié)合光密度掃描可進行定量分析

11、，具有微量、高通量、費用低等優(yōu)點，但結(jié)果易受實驗過程中蛋白類型、凝膠質(zhì)量、染色及脫色等一系列難以準確控制的操作過程的影響，定量分析準確性低8，且分離效果差。與PAGE比較，HPCE具有快速、簡單和高通量的特點，可以定性分析貯藏蛋白組分，但定量分析能力差。反相高效液相色譜法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）是定性定量分析蛋白及多肽混合組分的經(jīng)典方法，它利用貯藏蛋白各組分鍵合相表面疏水性差異對單體醇溶蛋白和經(jīng)還原處理后的單體谷蛋白亞基進行有效分離，使、/、醇溶蛋白和谷蛋白高低分子量亞基區(qū)域分開。根據(jù)各組分在特

12、定波長的吸收值獲得其相對含量，并借助標準蛋白計算各組分的絕對含量9。RP-HPLC首先用于分離小麥和玉米蛋白10, 11，隨后在定性定量分析小麥貯藏蛋白研究中得到廣泛應用。前人已對樣品提取、硬件設施及洗脫條件等方面進行了完善9，Larroque12建立了一套RP-HPLC的方法體系，在澳大利亞小麥品質(zhì)研究中廣泛應用。因此有必要將這一技術(shù)用于中國小麥品質(zhì)研究，但由于Glu-A3d和Glu-A3b在中國分布頻率較高，且與Glu-A1不易分辨，影響各類亞基的準確定量，加之試驗條件的差 異13, 14，這一分析體系對中國品種的應用效果并不理想（本實驗室未發(fā)表資料）。同時國內(nèi)還未見利用色譜法對小麥品質(zhì)進

13、行研究的報道，沒有可供有效利用的分析體系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此本研究借鑒Larroque12的方法，選用中國北方冬麥區(qū)兩個主栽品種中優(yōu)9507和京411，系統(tǒng)分析了柱溫、洗脫梯度、樣品量、提取時間和進樣體積等因素對RP-HPLC分離定量的影響，旨在建立適合中國小麥品種的貯藏蛋白反相色譜分析體系，為深入研究小麥貯藏蛋白和加工品質(zhì)的關(guān)系提供有效工具。1 材料與方法1.1 試驗材料冬小麥品種中優(yōu)9507和京411各2 kg，來自中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，用Buhler實驗磨制粉，出粉率分別為75.6%和76.0%，面粉蛋白質(zhì)含量分別為13.3%和10.6%（14%濕基）。體系驗證使用的高優(yōu)5

14、03、皖麥33、小偃54、藁城8901、豫麥54、豫麥63、農(nóng)大3197和Hartog共8個品種代表了不同類型的高低分子量亞基組成，于2002年種植于安陽，Junior磨制粉，出粉率55%60%。1.2 試驗方法 試驗設計 針對溫度、洗脫梯度、樣品重量、提取時間和進樣體積等因素對貯藏蛋白分離分析的影響進行研究。溫度設50和60兩個梯度。洗脫梯度借鑒Larroque12的方法并加以改進，即07 min添加 24%B的等度洗脫，2329 min有機相梯度改為31%32%。樣品重量設20、30、45和60 mg共4個處理，提取時間設20、30、45和60 min共4個處理。醇溶蛋白進樣體積設5、10

15、、15、20和30 µl 共5個處理，谷蛋白進樣體積設10、15、20和25 µl共4個處理。使用確定的最佳提取條件對醇溶蛋白和谷蛋白分析進行重復性檢測。采用手動強制時間積分法獲取各組分的吸收值和相對含量。 色譜分析硬件及軟件系統(tǒng) 色譜系統(tǒng)為Waters 2695色譜儀 + Waters 2996 PDA檢測器，樣品環(huán)體積250 µl，工作站軟件Millium32。色譜柱為Vydac 218TP104 C18反相分析柱（250 mm×4.6 mm，粒徑10 µm，孔徑300 Å），預柱為Vydac 218GP104 C18。 試劑 乙

16、腈（Fisher）、正丙醇（Tedia）和三氟乙酸（Tedia）均為HPLC級。二硫蘇糖醇（Sigma）、4-乙烯吡啶（Alfa Aesar）、尿素（Sigma）、Tris（Amersco）和鹽酸（Amersco）均為超純級。純水系統(tǒng)為Milli-Q Gradient A10。 樣品提取及洗脫條件 醇溶蛋白提取液采用50%（v/v）正丙醇，麥谷蛋白提取液為50%正丙醇（v/v）+2 mol·L-1尿素+0.2 mol·L-1 Tris-HCl（pH 6.6）+1% DTT（w/v）。用萬分之一天平準確稱取樣品于1.5 ml離心管，加入1 ml醇溶蛋白提取液，分別震蕩不同時間

17、，離心后取上清用于醇溶蛋白第1次提取分析；再連續(xù)兩次在沉淀中加入1 ml醇溶蛋白提取液，分別提取30 min和10 min，離心，取上清，用于第2次和第3次提取分析（殘留分析）。3次醇溶蛋白提取后在沉淀中加入1 ml谷蛋白提取液，于65水浴分別提取不同時間，期間旋渦1次，離心，取上清，加入10 µl 4-乙烯吡啶，65水浴15 min，冷卻后用于谷蛋白第1次提取分析；再連續(xù)2次在沉淀中加入1 ml谷蛋白提取液，分別提取60 min和30 min，離心，取上清，加入10 µl 4-乙烯吡啶，用于第二次和第三次提取分析（殘留分析）。每次提取先旋渦2 min，離心條件為17 00

18、0 g（室溫），6 min。所有樣品進樣前用0.45 µm尼龍膜過濾。流動相A為含有0.07%（v/v）三氟乙酸的超純水，流動相B為含有0.05%（v/v）三氟乙酸的乙腈。醇溶蛋白洗脫梯度采用1 min 25% B，46 min 50% B；谷蛋白洗脫梯度采用7 min 24% B，23 min 31% B，29 min 32% B，67 min 48% B。 統(tǒng)計分析 用Statistical Analysis System（SAS Institute，1997）統(tǒng)計分析軟件進行方差分析和顯著性測驗。2 結(jié)果與分析2.1 柱溫對分離效果的影響不同柱溫下中優(yōu)9507和京411貯藏蛋白

19、各組分分離效果見圖1。根據(jù)Larroque12對醇溶蛋白和谷蛋白峰譜鑒定方法可以看出，中優(yōu)9507和京411在50和60兩種溫度條件下醇溶蛋白和谷蛋白不同亞基的保留時間和選擇性明顯不同，溫度提高后各組分分離效果顯著提高。60柱溫條件下分離效果好，主要表現(xiàn)為、/和醇溶蛋白3個組分及HMW-GS和LMW-GS間均沒有發(fā)生重疊，同時HMW-GS和LMW-GS各亞基也得到了較好分離。2.2 洗脫梯度對分離效果的影響用Larroque12醇溶蛋白洗脫梯度對醇溶蛋白進行AUAUAUAU圖1 中優(yōu)9507醇溶蛋白（A）、京411醇溶蛋白（B）、中優(yōu)9507谷蛋白（C）和京411谷蛋白（D）不同溫度下的分離圖

20、譜Fig. 1 The elution profiles of gliadins (A, Zhongyou 9507; B, Jing 411) and glutenins (C, Zhongyou 9507; D, Jing 411)分析，各組分間沒有發(fā)生重疊，分離明顯（圖略）。AU用谷蛋白洗脫梯度（0 min 24%B，55 min 48%B）進行分析，品種間谷蛋白分離效果不同。由于Glu-A3亞基與Glu-A1亞基疏水性接近，并緊隨Glu-A1亞基洗脫，故兩者容易共洗脫。京411具有Glu-A3c亞基，與HMW-GS部分分離明顯，中優(yōu)9507具有Glu-A3d（圖中箭頭所指屬于Glu-A

21、3d），與Glu-A1的高分子量亞基出現(xiàn)了嚴重重疊（圖2-A），影響亞基的準確定量分析。因此2329 min插入有機相變化1%的平緩梯度，提高了這一區(qū)域的分離度（圖2-B）。從圖2還可看出，該平緩梯度對隨后洗脫的低分子量谷蛋白組分分離也沒有明顯影響，在洗脫開始添加的7 min等度洗脫也在一定程度上消除了提取試劑中4-乙烯吡啶對谷蛋白分離的噪聲影響。AU2.3 樣品重量和提取時間對貯藏蛋白提取率的影響對不同處理第3次提取的醇溶蛋白和谷蛋白進行分析，與第1次和第2次的提取分析結(jié)果相比，未出現(xiàn)明顯的吸收峰，說明沒有明顯殘留，因此可以使用第1次和第2次的提取結(jié)果計算提取率（提取率為第1次蛋白提取量占兩

22、次提取總量的百分比），將不同樣品重量和提取時間對貯藏蛋白提取效果的影響分別列于表1和表2。從表1可以看出，不同樣品量間提取率差異顯著。2060 mg范圍內(nèi)，隨著樣品量的增加，醇溶蛋白、高低分子量谷蛋白亞基的提取率顯著提高，45 mg樣品量可以使貯藏蛋白各組分的提取率達90%。從表2可以看出，提取時間對提取率的影響隨貯藏蛋白組分和品種的不同而變化。醇溶蛋白和中優(yōu)9507高低分子Minutes圖2 兩種梯度下中優(yōu)9507谷蛋白分離圖譜Fig. 2 A and B show the elution profiles of glutenin of Zhongyou 9507 with differen

23、t gradient, respectively表 1 不同樣品重量中優(yōu)9507和京411貯藏蛋白的提取率Table 1 Effect of different sample weight on gluten protein extraction rate of Zhongyou 9507 and Jing 411樣品重量Sample weight (mg)中優(yōu)9507 Zhongyou 9507 (%)京411 Jing 411 (%)GliadinHMW-GSLMW-GSGliadinHMW-GSLMW-GS20 81.08 d88.56 d89.45 d80.57 d75.21 d87.

24、33 d30 89.15 c92.78 c90.28 c88.83 c82.50 c90.76 c45 90.28 b95.56 b92.86 b90.54 b89.66 b91.19 b60 91.76 a96.41 a93.39 a91.60 a92.83 a92.88 a不同字母表示5%顯著水平。下同Different letters indicate significant difference at 5% probability level. The same as below表 2 不同提取時間中優(yōu)9507和京411貯藏蛋白的提取率Table 2 Effect of differe

25、nt duration on gluten extraction rate of Zhongyou 9507 and Jing 411提取時間Duration (min)中優(yōu)9507 Zhongyou 9507 (%)京411 Jing 411 (%)GliadinHMW-GSLMW-GSGliadinHMW-GSLMW-GS20 86.62 d93.23 d91.65 b87.02 d85.25 a91.24 a30 88.53 b93.33 b91.16 d87.41 c84.93 d90.61 b45 89.45 a93.58 a91.93 a88.58 a85.04 b90.34 c6

26、0 87.66 c93.17 c91.25 c88.53 b84.99 c89.97 d量谷蛋白亞基45 min提取時間的提取率最高，而京411高低分子量谷蛋白亞基20 min的提取率最高，其次為45 min?？傮w來看，中優(yōu)9507和京411醇溶蛋白提取率基本相同，而中優(yōu)9507谷蛋白亞基的提取率顯著高于京411。2.4 進樣體積對組分量化及分離效果的影響采用上述試驗得到的45 mg樣品量和45 min提取時間，進行了進樣體積對貯藏蛋白組分量化影響的分析，結(jié)果列于表3?？梢钥闯?，進樣體積影響貯藏蛋白各組分的相對含量。隨進樣體積的增加，醇溶蛋白和LMW-GS部分的相對含量減少，/、醇溶蛋白和HM

27、W-GS部分的相對含量增加。中優(yōu)9507和京411的醇溶蛋白部分的變幅最大，分別為5.23%和3.18%。京411谷蛋白亞基相對含量的變幅大于中優(yōu)9507。為了確定合適的進樣體積，醇溶蛋白和谷蛋白分別以最小進樣體積5 µl和10 µl的吸光值為參比，計算進樣體積吸光值的相對倍比，結(jié)果列于表4?？梢钥闯觯袃?yōu)9507各組分實際倍比與理論倍比的偏離度隨進樣體積的增大而增大。其中醇溶蛋白中部分和谷蛋白中HMW-GS部分的偏離較大，而/和醇溶蛋白、LMW-GS部分以及醇溶蛋白和谷蛋白總量的偏離度相對較小。醇溶蛋白進樣10 µl /15 µl、谷蛋白進樣15 &#

28、181;l /20 µl時醇溶蛋白和谷蛋白總量以及各組分的吸光值倍比最接近理論值。京411結(jié)果類似（詳細資料未列出）。因此醇溶蛋白和谷蛋白合適的進樣體積范圍分別為515 µl和1020 µl。進樣體積對醇溶蛋白和谷蛋白各組分的分離效果沒有明顯影響。2.5 分析重復性驗證在上述分析的基礎上，選用中優(yōu)9507檢驗PR-HPLC連續(xù)重復進樣和重復提取分析的準確性，結(jié)果列于表5。可以看出，貯藏蛋白各組分和總量在重復進樣間和重復樣品間的變異系數(shù)都小于1.5%。因此，單次提取配合單針分析即可對樣品進行客觀評價，并用于多樣品間的橫向比較，不需對每個樣品進行重復提取和進樣分析，可

29、大大節(jié)省試驗成本。為了進一步驗證該方法的有效性，應用已建立的最佳分析條件對8個代表性品種進行了分析，4個品種的結(jié)果如圖3?？梢钥闯觯既艿鞍缀凸鹊鞍赘鹘M分分離明顯，沒有發(fā)生重疊。不同的高分子量谷蛋白亞基都能得到較好地分離，包括利用SDS-PAGE很難分離的Glu-B1 13+19/14+15以及7+8/7+8*。表3 進樣體積對貯藏蛋白各組分百分含量的影響Table 3 Effect of different injection volume on relative content of gluten protein components 體積Injection volume (µl

30、)中優(yōu)9507 Zhongyou 9507 (%)京411 Jing 411 (%)/HMWLMW/HMWLMW 518.7451.4329.8314.6448.7636.601017.8151.1231.0721.5178.4914.4449.1036.4618.5081.501517.1151.2431.6623.1176.8913.7449.0837.1820.2779.732016.1751.6832.1623.0676.9413.2149.5337.2621.6678.342523.7076.3023.3176.693013.5153.2633.2311.4650.5937.95表中

31、“-”表示沒有相應處理。下同“-” indicate that the corresponding treatment doesnt exist. The same as below表4 進樣體積對中優(yōu)9507貯藏蛋白各組分吸光值的影響Table 4 Effect of different injection volume on zhongyou9507 gluten protein components absorbance area進樣體積Injectionvolume (µl)理論倍比Theoreticaltimes實際倍比-actualtimes/實際倍比/-actualti

32、mes實際倍比-actualtimesGli實際倍比Gli-actualtimes理論倍比TheoreticaltimesHMW實際倍比HMW- actualtimesLMW實際倍比LMW- actualtimesGlu實際倍比Glu- actualtimes 5 1.001.001.001.001.0010 2.001.901.982.082.001.001.001.001.0015 3.002.773.033.223.041.501.591.451.4820 4.003.464.034.334.022.002.161.972.0125 2.502.802.472.5430 6.004.24

33、6.106.565.89進一步對8個品種的貯藏蛋白進行量化x/y型亞基比值藁城8901最高為4.97，農(nóng)大3197最低為3.51。、/和醇溶蛋白的相對含量也明顯不同，其中/和醇溶蛋白為大量部分，占醇溶蛋白總量的40%以上。表 5 貯藏蛋白RP-HPLC分析重復性驗證Table 5 Repeat ability of RP-HPLC analysis of gluten protein 組份類型Type of components重復進樣均值（相對面積）Average of repeat injection (Relative area)變異系數(shù)C.V.重復提取均值（相對面積）Average o

34、f repeat extraction (Relative area)變異系數(shù)C.V.醇溶蛋白Gliadin68867840.7268029940.76/195611530.45193632390.48122544130.57121700671.47Total Gliadin 387023500.44383363000.52谷蛋白GluteninHMW-GS38614581.1338542921.30LMW-GS136668670.75146162130.94Total Glutenin 175283250.83184705050.96A/E、B/F、C/G、D/H分別代表高優(yōu)503、皖麥33

35、、小偃54和藁城8901A/E, B/F, C/G and D/H indicate Gaoyou 503, Wanmai 33, Xiaoyan 54 and Gaocheng 8901, respectively圖3 不同品種醇溶蛋白和谷蛋白峰譜Fig. 3 The gliadin and glutenin elution profiles of different cultivars表6 不同品種貯藏蛋白組分量化分析Table 6 Quantitative analysis of gluten protein品種CultivarHMW-GSLMW-GS/HMW/LMWx/y-HMWDyB

36、yDxBxAxTotal高優(yōu)503 Gaoyou 5031.172.756.399.453.5623.3276.6813.2046.3940.410.304.94皖麥33 Wanmai 331.642.897.079.053.6424.3075.7014.7947.6137.600.324.36小偃54 Xiaoyan 541.102.706.307.952.9621.0079.0012.4545.8941.660.274.53藁城8901 Gaocheng 89011.812.587.6810.333.8226.2373.7711.6442.6845.680.364.97豫麥54 Yumai

37、 541.663.446.568.822.6123.1076.9012.3947.8339.780.303.53豫麥63 Yumai 631.051.465.686.2514.4585.5511.9045.8742.230.174.74農(nóng)大3197 Nongda 31971.342.646.027.9517.9582.0510.3349.6240.050.223.51Hartog1.802.906.878.503.8523.9276.0812.1443.1644.700.314.09表中數(shù)值表示不同貯藏蛋白組分的百分含量，“”表示Ax位點不表達The data indicate the rel

38、ative content of different gluten protein components, and “” indicate the Ax locus is null3 討論色譜柱是進行RP-HPLC分析的關(guān)鍵硬件，直接影響貯藏蛋白組分的分離效果15。本研究選用C18反相分析柱Vydac 218TP104對小麥貯藏蛋白進行了分析，分離效果和重復性均較好，這與Bietz等10和Lookhart等15的結(jié)果一致。柱溫直接影響被分離組分的選擇性和分離效果，大部分研究使用5070，目的以得到較好的分離效果，并減少各組分間的重疊。本研究表明，60柱溫可使小麥貯藏蛋白較好分離。洗脫梯度是分離

39、貯藏蛋白的關(guān)鍵參數(shù)，應具有分析時間短、分離效果好、組分重疊小和重復性好的特點。Larroque12研究表明，Glu-A3由于具有較低的疏水作用力，保留時間較短，易與Glu-A1亞基共洗脫，其中Glu-A3a/c/e與GluA1可以較好的分離，而Glu-A3 b/d與Glu-A1易發(fā)生嚴重重疊。劉麗等14研究表明，中國秋播麥區(qū)主栽品種和高代品系中含Glu-A3d和Glu-A3b的品種占32.3%，因此提高Glu-A3與Glu-A1的分離效果對于中國小麥貯藏蛋白的定量分析非常重要。本試驗借鑒了Larroque12的方法，對谷蛋白分析梯度進行了部分改進，在Glu-A3和Glu-A1洗脫時間段插入有機

40、相變化1%的平緩梯度，使Glu-A1和Glu-A3得到較好分離，提高了高低分子量谷蛋白亞基定量的準確性。樣品重量和提取時間直接影響貯藏蛋白的提取率。本研究表明，45 mg樣品量和45 min提取時間可以使提取率達到90%，中優(yōu)9507谷蛋白的提取率顯著高于京411，這可能是由于中優(yōu)9507蛋白質(zhì)含量和谷蛋白含量較高所致。已有數(shù)據(jù)的分析表明，相同樣品重量中優(yōu)9507的谷蛋白亞基含量是京411的2倍左右，尤其是其高分子量谷蛋白亞基顯著高于京411。因此，蛋白含量高，谷蛋白亞基含量高的品種，其谷蛋白提取率也較高。Wieser等9用一個德國品種為材料，深入研究研究了貯藏蛋白的RP-HPLC分析方法，醇

41、溶蛋白和谷蛋白提取率分別可達到96.0%和97.5%。但提取時間長，多次提取液的合并降低了分析重復性。本文建立的方法提取時間約為2.5 h，一次提取率達90%以上，同時使用4-乙烯吡啶對還原谷蛋白進行烷基化，有效防止還原亞基的二次氧化，延長了樣品貯藏時間。低進樣量雖然可提高分析的靈敏度，但在梯度洗脫中易受空白本底的影響，進樣量太大則使測定值低于實際值。本研究表明，醇溶蛋白和谷蛋白合適的進樣體積分別為515 µl和1020 µl，考慮到空白本底的影響，醇溶蛋白1015 µl和谷蛋白1520 µl可以使空白本底相應積分區(qū)間的吸收值占該區(qū)間總吸收值的比例降低到

42、10%以下，可作為醇溶蛋白和谷蛋白分析的最佳進樣體積范圍。4 結(jié)論本研究對小麥貯藏蛋白RP-HPLC分析關(guān)鍵參數(shù)和試驗條件進行系統(tǒng)研究，總結(jié)為45 mg樣品量，1 ml提取體系對醇溶蛋白和谷蛋白一次提取45 min，谷蛋白樣品烷基化15 min。醇溶蛋白和谷蛋白分別進樣1015 µl和1520 µl。柱溫60，醇溶蛋白洗脫梯度為1 min 25%B，46 min 50%B；谷蛋白洗脫梯度為7 min 24%B，23 min 31%B，29 min 32%B，67 min 48%B。8個代表性品種進一步驗證了該體系的準確性和可行性。該體系配合SDS-PAGE可對不同類型高低分

43、子量谷蛋白亞基和醇溶蛋白組分進行系統(tǒng)鑒定和量化，并用于小麥品質(zhì)預測研究。References1Khatkar B S, Bell A E, Schofield J D. The dynamic rheological properties of glutens and gluten subfractions from wheats of good and poor bread making quality. Journal of Cereal Science, 1995, 2: 29-44.2Wieser H, Zimmermann G. Importance of amounts and p

44、roportions of high molecular weight subunits of glutenin for wheat quality. European Food Research and Technology, 2000, 210: 324-330.3Lukow O M, Forsyth S A, Payne P I. Over-production of HMW glutenin subunits coded on chromosome 1B in common wheat, Triticum aestivum. Journal of Genetics and Breedi

45、ng, 1992, 46: 187-191.4Uthayakumaran S, Gras P W, Stoddard F L, Bekes F. Effect of varying protein content and glutenin-to-gliadin ratio on the functional properties of wheat dough. Cereal Chemistry, 1999, 76: 389-394.5朱金寶, 劉廣田, 張樹榛, 孫 輝. 小麥籽粒高低分子量麥谷蛋白亞基及其與品質(zhì)關(guān)系的研究.中國農(nóng)業(yè)科學, 1996, 29: 34-39.Zhu J B, Li

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