基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜

1、基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜在寡糖結構分析中的應用項目完成單位：國家生物醫(yī)學分析中心項目完成人：劉炳玉 谷苗 桑志紅 王鴻麗 劉峰 魏開華 楊松成1. 前言寡糖和多糖具有調節(jié)抗體水平、增強免疫功能、抗腫瘤、抗感染等作用,在肝炎、風濕病和愛滋病等重大疾病診療上應用價值大。它還具有抗消化性潰瘍、降血糖、降血脂、抗血栓、抗輻射、抗毒物損傷、抗暈、祛痰鎮(zhèn)咳、誘導干擾素產生、促進血功能恢復以及促進蛋白質和核酸的生物合成等方面的生物活性，在國內外（尤其我國傳統(tǒng)醫(yī)學中）應用十分廣泛。糖類化合物結構比蛋白質和核酸復雜得多，包括單糖及其衍生物、寡糖、多糖、復合多糖和糖苷類，糖鏈由含多元羥基并順反異構環(huán)狀己

2、或戊糖通過苷鍵連接而成,各單糖有五個手性碳且連接位置和構型多種多樣。要闡明一種糖結構,必須了解: (1) 分子量;(2) 單糖殘基組成; (3) 單糖殘基間的順序; (4) 單糖殘基在糖苷鍵中的位置; (5) 環(huán)狀結構的類型; (6) 糖苷鍵的構型。糖的組成復雜,結構相似,沒有顯色基團,難以不經衍生就進行光譜、色譜分析,但質譜不受此影響。早期研究糖結構的質譜方法主要是快原子轟擊電離質譜（FAB-MS），可以顯示碎片離子,但有時候檢測不到分子離子峰，而且，FAB-MS的分子量范圍小、靈敏度不高1。以基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDITOFMS) 和電噴霧質譜（ESI-MS）為代表的生物

3、質譜打開了質譜分析研究生物大分子的新領域,并很快發(fā)展成為能在多個層次上分析研究生物分子的生物質譜學(Biological Mass Spectrometry , BMS) 2-4。近年來，ESIMS已在糖的結構分析中顯示出強大的生命力。它無需衍生化就能確定寡糖的結構、聚合度及組成，并能精確測定糖蛋白的分子量及其中寡糖的序列及結構均一性，還能區(qū)分寡糖是O一還是N連接的，常被用于糖型（glycoform）的分析5。但是，ESI-MS受樣品中的無機鹽和溶劑中干擾物的影響比較大，常導致其表觀靈敏度不高。相反，MALDI-TOF-MS的干擾物忍受力要比ESI-MS強得多，它的表觀靈敏度比ESI-MS高；

4、MALDI-TOF-MS的圖譜因為沒有ESIMS中的多電荷特性而更容易解析。另外，MALDI-TOF-MS的樣品制備以及儀器調節(jié)也比ESIMS系統(tǒng)簡單。因此，MALDI-TOF-MS成為當前研究蛋白質等生物大分子的首選技術。Hillenkamp等6人報道了用MALDI-TOF-MS精確地測定ng級的葡聚糖，分子量達7000 u。另外，源后裂解技術(PSD) 通過將側鏈或骨架打斷，從碎片的質量數分布可推測母離子的結構，主要用于糖鏈結構以及取代基種類、取代位置、分布情況以及取代數量等情況的研究7-8。2. 材料與方法2.1 材料糖樣本SXY1306系列，SXY1572系列，SXY13000系列?！?/p>

5、酸水解及GC法”定性分析單糖組成，LC分析表明相對純度大于97?；|-氰基-4-羥基肉桂酸（-CCA）、芥子酸（SA）、2，5-二羥基苯甲酸（DHB）均購自 Bruker 公司。三氟乙酸（TFA）、乙腈（ACN）均為美國進口試劑。實驗用水為MilliQ處理后的水。2.2 儀器德國 Bruker 公司MALDI-TOF-MS（Autoflex）； 糖樣本SXY1306和SXY1572系列（分子量小于2000U）用反射檢測方式，飛行管長1.70M；SXY13000系列（分子量大于10000U）用線性檢測方式；飛行管長1.22M；氮激光器波長337nm。2.3 方法樣品：取各樣品適量，用含/不含0.

6、5% TFA溶劑溶解。基質：將CCA、SA、DHB 分別溶于含/不含0.1% TFA 的 50% 乙腈溶液中，制成飽和溶液，離心，取上清液。點靶：取SXY1306系列和SXY1572系列各1ul，分別和1ul的CCA及DHB混合，取1ul點于Scout384樣品靶上；取SXY13000系列1ul，分別與1ul DHB、SA及CCA混合，取1ul點于Scout384樣品靶上，待自然干燥后置儀器中測定。3. 結果與討論3.1 基質的篩選采用負離子檢測方式。對于SXY1306系列和SXY1572系列（分子量小于2000U），重點比較DHB與CCA的差異；結果表明：兩者在“靈敏度、準確度等”方面并無明

7、顯差異（圖1 A ,B），這與大多數文獻報道的略不同。對于SXY13000系列（分子量大于10000U），重點比較SA與CCA的差異。結果表明：SA的靈敏度明顯優(yōu)于CCA（圖2）。準確度上未發(fā)現明顯差異。3.2 檢測方式對于SXY1306系列和SXY1572系列，兩種方式均可得到樣品離子峰，但負離子方式比正離子方式的加成峰等雜峰少（圖1C , D）。另外，在正離子方式時，DHB比CCA略好（加成峰等雜峰少）。負離子方式時，兩種基質無明顯差異。由此可見，正離子方式在檢測小分子量的糖時，主要問題是產生一些基質等對樣品的加成離子，使得譜圖解析難點增加。另外，正離子方式可能有助于產生一些寡糖碎片峰，這

8、有利于寡糖結構解析。關于“正離子方式下寡糖的源內裂解”問題正在進一步研究。對于SXY13000系列， DHB,CCA,SA三種基質的正離子方式均未檢測出樣品離子峰。說明，隨著分子量的增加，糖鏈環(huán)和氧橋捕獲氫離子的能力大大下降。相反，負離子條件下，活潑氫仍可以較容易的被基質負離子奪走。因此，正、負離子檢測大分子量糖類時，可以部分反映出糖鏈的空間折疊情況。3.3 制樣方法質譜的制樣技術對分析結果有比較重要的影響。傳統(tǒng)的寡糖樣品常在堿性條件下進行（如氨水體系，碳酸氫銨體系等），但實驗觀察到，堿性對于基質結晶有一定的負面影響（顆粒太大），而且也難以在正離子方式檢測（通過正負離子檢測確認分子離子峰是很有

9、效的方法）。因此，本項目探索的方法是：純水體系（不加TFA、甲酸等酸化試劑）。3.4 PSD技術研究寡糖結構SXY1306系列和SXY1572系列樣品，采用13步收集策略，對m/z1572等高豐度離子峰進行了PSD分析。結果表明：負離子PSD比正離子方式的離子碎片少得多；而正離子方式下的PSD的碎片分析較復雜，需要專門的分析軟件。另外，對于寡糖，正離子方式中的加成離子的問題對于PSD分析并無影響。ABCD圖1 基質對寡糖的MALDI-TOF-MS的影響（A）CCA 負離子（B）DHB負離子（C）CCA 正離子（D）DHB 正離子參考文獻1 Yoko Ohashi, etc. Analysis

10、of sugar epimers using mass spectrometry: N-acetyllactosamine-6,6-disulfate and the 2-epimer. Eur. J. Mass Spectrom.， 2004，1：269 - 2782 楊松成. 蛋白質組學中的有機質譜. 現代科學儀器，2000，5：93 趙曉光，薛燕，劉炳玉. MALDITOF質譜儀關鍵技術及進展. 現代儀器，2003，4：174 M. Karas, U. Bahr, A. Ingendoh, F. Hillenkamp, Introduction of MALDI-TOF. Angew. Chem. 1989, 101：805-8065 劉翠平，方積年. 質譜技術在糖類結構分析中的應用. 分析化學，2001，29（6）：7167206 B. Stahl, A. Linos, M. Karas, F. Hillenkamp, M. Steup. Analysis of fructans from higher plants by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analyt. Biochem. 1997，246：195-2047 王杰，