動(dòng)態(tài)比濁法對(duì)注射用輔酶A細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的研究

1、    動(dòng)態(tài)比濁法對(duì)注射用輔酶A細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的研究        摘要采用動(dòng)態(tài)比濁定量法檢測(cè)注射用輔酶A細(xì)菌內(nèi)毒素含量，減少由于供試品本身含有細(xì)菌 內(nèi)毒素對(duì)檢查法研究的影響。結(jié)果表明，供試品濃度為0.125iu/ml時(shí)可排除干擾因素，以標(biāo)示靈敏度為0.125Eu/ml的鱟試劑可用于本品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，與部頒標(biāo)準(zhǔn)熱原檢查結(jié)果一致。關(guān)鍵詞注射用輔酶A動(dòng)態(tài)比濁法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法干擾實(shí)驗(yàn)輔酶A為體內(nèi)乙酰反應(yīng)的輔酶，對(duì)糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝起重要作用。注射用輔酶A(Coenzym e

2、A)為部頒標(biāo)準(zhǔn)1所載品種，熱原檢查采用家兔法。本文應(yīng)用中國(guó)藥典(95版)二 部 2細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，探討輔酶A細(xì)菌內(nèi)毒素檢查可行性；采用動(dòng)態(tài)比濁定量法預(yù) 先檢測(cè)供試品內(nèi)毒素含量可以提高結(jié)果的可靠性。1實(shí)驗(yàn)材料1.1細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，規(guī)格10Eu/支，批號(hào)9606，中國(guó)藥品生物制品檢定所制。1.2鱟試劑，靈敏度0.5Eu/ml，批號(hào)990729；靈敏度0.25Eu/ml，批號(hào)990414，靈 敏度0 .125Eu/ml，批號(hào)990402；靈敏度0.06Eu/ml，批號(hào)980318；均為湛江海洋生物制品廠生產(chǎn) ，使用同廠生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。1.3注射用輔酶A，批號(hào)990504，開(kāi)封雙匯生

3、化制藥廠。1.4細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀BET-16，天津大學(xué)無(wú)線電廠。1.5電熱恒溫水浴箱19A，德國(guó)Julabo。旋渦混合器MSI(德國(guó))。實(shí)驗(yàn)所用器皿經(jīng)250干 烤1h除去外源性內(nèi)毒素。2方法與結(jié)果2.1細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定文獻(xiàn)記載3 藥品細(xì)菌內(nèi)毒素限值 L= K/M, 式中K值國(guó)際規(guī)定靜脈注射為5.0 Eu/ kg。部頒 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定本品熱原檢查配成濃度為5iu/ml，劑量1ml/kg靜脈給藥，即M值為5iu/kg，因此本 品L值為1Eu/iu。2.2供試品的最大有效稀釋倍數(shù)和供試品濃度供試品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)按下式計(jì)算：MVD=CL/其中C=5iu/ml,L=1Eu/iu。當(dāng)采用

4、為0.5、0.25、0.125、0.06Eu/ml的鱟試劑，MVD分 別為10、20、40、80，其相應(yīng)的供試品濃度為0.5、0.25、0.125、0.06iu/ml。2.3鱟試劑靈敏度復(fù)核按中國(guó)藥典(95版)二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果顯 示，實(shí)驗(yàn)所用鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)干擾實(shí)驗(yàn)。2.4供試品內(nèi)毒素含量測(cè)定2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備采用動(dòng)態(tài)濁度定量法，用細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀檢測(cè)一系列連續(xù)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 ，并以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水做陰性對(duì)照，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(檢測(cè)時(shí)間：8400秒)。1(=0.125 Eu/ml)。1動(dòng)態(tài)-濁度定量法標(biāo)準(zhǔn)曲線(T50歸一化法)2.4.2供試

5、品內(nèi)毒素的含量用細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀定量檢測(cè)一系列濃度的供試品溶液(檢測(cè)時(shí)間：8400秒)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 結(jié)果表明供試品各溶液含細(xì)菌內(nèi)毒素均<0.01Eu/iu。很微量的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不產(chǎn)生 影響。2.5干擾試驗(yàn)2.5.1供試品干擾試驗(yàn)根據(jù)所用鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(b)配制供試品的相應(yīng)濃度，用各個(gè)濃度的供試品溶液將細(xì) 菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成不同濃度細(xì)菌內(nèi)毒素溶液。按鱟試劑靈敏度復(fù)核方法檢測(cè)，并用細(xì)菌內(nèi) 毒素檢查用水做陰性對(duì)照，當(dāng)Et值在0.52.0Es時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度時(shí)對(duì)鱟試驗(yàn)不存 在干擾作用3。結(jié)果見(jiàn)表1。從表1看出，供試品的濃度為0.5iu/ml(MVD=10)和0.25iu/m

6、l(MVD=20)時(shí)有干擾作用。最高 無(wú)抑制濃度為0.125iu/ml，最大有效稀釋倍數(shù)為40。2.6注射用輔酶A細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與家兔法比較對(duì)3個(gè)廠家27批樣品分別用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成0.125iu/ml，用靈敏度0.125Eu/ml 的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均為陰性，與家兔法結(jié)果一致。表1注射用輔酶A干擾試驗(yàn)結(jié)果(n=30)標(biāo)示b Eu/ml供試品濃度細(xì)菌內(nèi)毒素濃度(Eu/ml)陰性對(duì)照 EsEt10.50.250.1250.060.030.0150.5無(wú)熱原水+- -0.2510(0.5iu/ml)+-+-0.210.25無(wú)熱原水+- -0.12520(0.25iu/ml)

7、+-0.060.125無(wú)熱原水+- -0.12540(0.125iu/ml)+- -0.070.06無(wú)熱原水+- -0.08780(0.06iu/ml)+- -0.053討論3.1本文采用動(dòng)態(tài)濁度定量法檢測(cè)注射用輔酶A的細(xì)菌內(nèi)毒素，可以減少供試品本身含有 細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。3.2本品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有一定干擾作用，但供試品濃度為0.125iu/ml時(shí)可排除干擾 因素。以標(biāo)示靈敏度為0.125Eu/ml或更高靈敏度的鱟試劑可用于樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。 3.3本法經(jīng)多個(gè)廠家產(chǎn)品檢測(cè)均與家兔法結(jié)果一致，但較家兔法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速和靈敏 度高。許惠英（廣東省人民醫(yī)院廣州 510180）劉偉祥（廣東省人民醫(yī)院廣