外傷性視神經(jīng)損傷動物模型的建立及F_VEP評價

1、外傷性視神經(jīng)損傷動物模型的建立及F_VEP評價    摘要目的建立視神經(jīng)損傷和視神經(jīng)損傷復合晶狀體損傷動物模型,了解2種模型損傷后不同時間閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)的變化規(guī)律。方法應用液壓沖擊顱腦損傷儀(FPI)建立兔外傷性視神經(jīng)損傷模型和視神經(jīng)損傷復合晶狀體損傷模型。于損傷前及損傷后1、2、4、7、10、14、21、28 d行F-VEP檢查并進行比較,并于上述各時間點制作視網(wǎng)膜切片,采用免疫組織化學法檢測視網(wǎng)膜中巨噬細胞的數(shù)量,用焦油紫染色標記存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs),對存活的RGCs進行計數(shù)。結(jié)果損傷后1 d,實驗組與對照組的P100波

2、隱含值和振幅降低,與損傷前相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。損傷后實驗組P100波隱含值延長的時間與對照組相比持續(xù)的時間短(P<0·05), 14 d后實驗組比對照組P100波隱含值恢復得更快(P<0·05)。實驗組隨著損傷時間的延長巨噬細胞數(shù)量明顯增加(P<0·05),而RGCs存活數(shù)逐漸減少(P<0·05),至損傷后28 d有所恢復。對照組表現(xiàn)出相同的變化趨勢。結(jié)論應用FPI可以成功建立外傷性視神經(jīng)損傷動物模型。視網(wǎng)膜組織病理學檢測結(jié)果印證了F-VEP的檢查結(jié)果。關鍵詞視神經(jīng)損傷;視網(wǎng)膜;晶狀體;視覺誘發(fā)

3、電位;視功能外傷性視神經(jīng)損傷是嚴重的致盲性疾病,對其治療及損傷修復機制等方面的研究均基于合適的視神經(jīng)損傷動物模型的建立1。由于損傷模型建立方法的不同,動物損傷后的視覺電生理結(jié)果也各不相同。視覺誘發(fā)電位(visualevoke potentia,l VEP)是檢測外傷性視神經(jīng)損傷一種客觀而敏感的電生理指標,對外傷性視神經(jīng)損傷的評價有重要價值2。閃光視覺誘發(fā)電位(flashVEP,F-VEP)波形穩(wěn)定,重復性好,且無性別或眼別的差異3。本研究應用液壓沖擊顱腦損傷儀(fluid percussion brain injury device,FPI)建立一種穩(wěn)定的兔視神經(jīng)損傷模型以及視神經(jīng)損傷復合晶狀

4、體損傷模型,研究2種模型在損傷后不同時期F-VEP的變化規(guī)律,為進一步研究視神經(jīng)損傷的修復機制奠定基礎1材料與方法1.1實驗動物及分組SPF級健康成年白兔64只,雌雄各半(天津醫(yī)科大學實驗動物中心提供),體重22·5 kg。分為實驗組和對照組,每只兔的右眼為實驗組(視神經(jīng)損傷+晶狀體損傷),左眼為對照組(視神經(jīng)損傷)。再依據(jù)損傷后1、2、4、7、10、14、21、28 d各觀察時間點按隨機數(shù)字表法隨機分為8個亞組,每組8只眼。1.2方法1.2.1視神經(jīng)損傷動物模型的制作體積分數(shù)10%水合氯醛4mL/kg麻醉動物,點4%倍諾喜滴眼液表面麻醉。沿10: 002: 00方位弧形剪開雙眼穹隆

5、部結(jié)膜。然后沿鞏膜外壁將自制的打擊管經(jīng)結(jié)膜切口伸入眼眶內(nèi)約1·5 cm,同時將白兔頭部固定在FPI架上打擊力量設定為(699·1±70·9)kPa。實驗組視神經(jīng)損傷后,以斜視鉤牽拉上直肌暴露眼球后部,用半寸針灸針從眼球赤道部垂直刺入鞏膜56mm,損傷晶狀體赤道部,對照組僅進行視神經(jīng)損傷。損傷后用妥布霉素滴眼液點雙眼,每日3次,預防感染。1.2.2F-VEP記錄方法及刺激參數(shù)參照國際臨床視覺電生理標準,使用美國Nicolet多功能電生理診斷儀檢測。體積分數(shù)10%水合氯醛4mL/kg麻醉動物,采用銀針電極(阻抗<15 k)檢測。記錄電極在枕骨隆凸上3m

6、m,參考電極在雙眼連線中點,地電極置于同側(cè)耳廓4。采用LED眼罩閃爍刺激,刺激頻率1·9Hz,通頻帶寬5100Hz,波寬0·2 ms,分析時間200ms,疊加70次,放大20倍。每只眼連續(xù)測量至少3次,每次間隔10min。檢測1只眼時,對側(cè)眼用不透光黑布完全遮蓋。每只眼記錄穩(wěn)定波形3次。記錄只兔損傷前的F-VEP,建立兔F-VEP隱含值和振幅的正常測量值范圍。分別記錄損傷后1、2、4、7、10、1421、28 d兔雙眼F-VEP波的隱含值和振幅。1.2.3組織病理學檢測分別取術(shù)后1、2、4、7、1421、28 d的視網(wǎng)膜、視神經(jīng)組織切片進行免疫組織化學染色,用ED-1抗體標

7、記巨噬細胞,然后對巨噬細胞進行計數(shù);另取同樣的組織切片進行焦油紫染色標記存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells,RGCs),進行計數(shù)。每隔24張切片取1張,共4張,要求以正好切到視盤的切面為中軸,前后各取2張。每張切片高倍鏡下隨機讀取10個視野的巨噬細胞數(shù)或存活的RGCs數(shù)并計算其總和,每個標本記錄4張切片細胞數(shù)總和的平均數(shù),分析實驗組與對照組不同時間點各亞組雙眼視網(wǎng)膜相應細胞數(shù)量的變化規(guī)律。1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 13. 0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理。實驗測試指標的數(shù)據(jù)資料以x±s表示,實驗組、對照組損傷前后不同時間點以及各組間F-VEP波隱含值和

8、振幅變化的比較進行兩因素方差分析,各時間點間和各組間的多重比較采用SNK-q檢驗。P<0·05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1F-VEP結(jié)果損傷前78·6%的白兔可引出典型的NPN波形,隱含值和振幅分別為(42·59±5·14)ms和(8·72±3·32)V(圖1)。實驗組損傷后1 d P100波隱含值為(103·59±11·36)ms,振幅為(6·58±3·39)V,與損傷前的隱含值和振幅相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。損傷

9、后1 d與損傷后10 d、損傷后10 d與損傷后28 d隱含值的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05);損傷后10 d內(nèi)隱含值逐漸延長(P<0·05),之后逐漸縮短(P<0·05)。損傷后1 d與損傷后7 d、損傷后7 d與損傷后28 d振幅的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05),各相鄰檢測時間點間振幅差異無統(tǒng)計學意義(P>0·05)。振幅在損傷后7 d內(nèi)逐漸降低(P<0·05), 7 d后逐漸升高(P<0·05)(圖2)。對照組損傷后1 d P100波隱含值為(105·53&#

10、177;16·59)ms,振幅為(6·32±2·12)V,與損傷前的隱含值和振幅相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。損傷后1 d與損傷后14 d、損傷后14 d與損傷后28 d隱含值的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。損傷后1 d與損傷后10 d振幅差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05),損傷后10 d與損傷后28 d振幅差異無統(tǒng)計學意義(P>0·05),各相鄰時間點間振幅差異無統(tǒng)計學意義(P>0·05)。損傷后14 d內(nèi)隱含值逐漸延長(P<0·05),14

11、d后有縮短趨勢(P<0·05);振幅在損傷后10 d內(nèi)逐漸降低(P<0·05), 10 d后有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0·05)(圖3)。實驗組與對照組間損傷后21 d、損傷后28 d隱含值的差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05),損傷后28 d振幅差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。實驗組隱含值的恢復快于對照組(P<0·05),損傷后14 d實驗組較對照組隱含值恢復得更快,更接近損傷前水平;損傷后28 d實驗組與對照組的振幅比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05)(表1)。2.2組織

12、病理學結(jié)果實驗組損傷后421 d各亞組間巨噬細胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。損傷后228 d各亞組間存活的RGCs數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。損傷后421 d,實驗組與對照組的巨噬細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。損傷后110 d,實驗組與對照組存活的RGCs數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0·05)(表2)。2.2.1ED-1抗體標記巨噬細胞計數(shù)實驗組巨噬細對照組巨噬細胞計數(shù):損傷后4 d與損傷后7 d差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05),損傷后4 d與損傷后10 d、4 d與14 d、7 d與

13、10 d、7 d與14 d、7 d與21 d、10 d與14 d、10 d與21 d、14 d與21 d差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。實驗組與對照組視網(wǎng)膜均在損傷后4 d開始出現(xiàn)巨噬細胞,之后逐漸增多,損傷后10 d達到高峰,之后逐漸減少, 28 d后消失;但實驗組各亞組巨噬細胞數(shù)量明顯多于對照組(P<0·05)(圖4,表2)。2.2.2焦油紫法檢測存活的RGCs實驗組存活的RGCs數(shù)量:損傷后1 d與損傷后7 d差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05),損傷后1 d與損傷后10 d、1 d與14 d1 d與21 d、2 d與7 d、2 d與10

14、d、2 d與14 d、2 d與21 d、4 d與10 d、4 d與14 d、7 d與10 d、7 d與28 d、10 d與14 d、10 d與21 d、10 d與28 d、14 d與28 d、21 d與28 d,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。實驗組從損傷后1 dRGCs數(shù)量開始逐漸減少,損傷后10 d達到最低(圖5), 10 d后RGCs數(shù)量逐漸回升(P<0·05),28 d后數(shù)量已恢復至損傷后2 4 d的水平(P>0·05)。對照組存活的RGCs數(shù)量:損傷后1 d與損傷后4 d差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05),損傷后1 d

15、與損傷后7 d、1 d與10 d、1 d與14 d、1 d與21 d、1 d與28 d、2 d與7 d、2 d與10 d、2 d與14 d、2 d與21 d、2 d與28 d、4 d與7 d、4 d與10 d、4 d與14 d、4 d與21 d、4 d與28 d、7 d與10 d、7 d與14 d、7 d與21 d、7 d與28 d、10 d與14 d、14 d與28 d差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。對照組損傷后1 d存活RGCs數(shù)量開始逐漸減少,損傷后14 d達到最低, 14 d后RGCs數(shù)量逐漸回升(P<0·05), 28 d后已恢復至損傷后10 d的

16、水平(P>0·05)(表2)。3討論外傷性視神經(jīng)損傷是眼科常見病,發(fā)病率為0·3% 5·2%,近年來發(fā)病率有增高的趨勢,預后不良, 40% 50%的患者可導致永久性失明5,目前對于視神經(jīng)損傷尚無較好的治療方法。有關外傷性視神經(jīng)損傷的治療及損傷修復機制等方面的研究均基于合適的視神經(jīng)損傷動物模型的建立1。實驗研究應采用具有臨床模擬性、穩(wěn)定性、可重復性、易操作性、可量化性等特點6的動物模型。以往的視神經(jīng)損傷動物模型大體分為兩類:一類是通過模擬臨床閉合性顱腦外傷,建立間接性視神經(jīng)損傷動物模型。但是由于間接性視神經(jīng)損傷的發(fā)病機制復雜,人與其他動物解剖結(jié)構(gòu)的差異,這種模

17、型不僅不能完全模擬臨床上的間接性視神經(jīng)損傷,而且成功率低、穩(wěn)定性差、不容易量化。另一類是通過各種方法暴露視神經(jīng),然后用切割橫斷、擠壓、牽引以及冷凍等方法造成視神經(jīng)的直接損傷。這種模型可直視視神經(jīng)損傷部位,可控性較強,損傷性質(zhì)可以具體化,容易量化,是目前視神經(jīng)損傷研究中所采用的主要動物模型,但是這種損傷模型臨床模擬性較差7-8。本研究應用FPI建立外傷性視神經(jīng)損傷動物模型,該模型具有臨床模擬性好、穩(wěn)定、可重復、易操作、可量化等優(yōu)點9-10。目前國內(nèi)外尚無應用其建立兔視神經(jīng)損傷模型的報道。其損傷的機制為: FPI的打擊錘從預定的角度落下,打擊液壓柱的橡皮活塞,擠壓管內(nèi)液體,形成液壓沖擊力,經(jīng)上瞼結(jié)

18、膜切口,作用于兔視神經(jīng),使視神經(jīng)直接受到外力沖擊的影響和擠壓作用,同時眶內(nèi)血管破裂引起視神經(jīng)缺血,建立原發(fā)性視神經(jīng)損傷模型。打擊錘從不同的高度落下,產(chǎn)生不同的打擊力量,通過壓力傳感器顯示的波形可精確地反映損傷部位所受力量的大小,因而可以精確地制作不同程度的視神經(jīng)損傷模型?？梢? FPI制作視神經(jīng)損傷模型的優(yōu)點在于很接近臨床狀態(tài)的間接視神經(jīng)損傷,損傷視神經(jīng)的同時保持了其完整性,傷情穩(wěn)定,重復性好,對操作者的依賴程度較小,且可大致定量致傷程度。致傷設備簡單,操作簡便;對于實驗動物創(chuàng)傷較小,手術(shù)層次清晰,死亡率較低,利于術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)觀察;與鉗夾傷相比,致傷率稍低,避免過于強調(diào)接近臨床狀態(tài)而浪費實驗動

19、物資源,但還應注意的是由于切口離視神經(jīng)的距離較近,傷口一旦感染將會迅速影響到視神經(jīng)。VEP是大腦皮層對視覺刺激產(chǎn)生的一簇電信號。F-VEP可用于視網(wǎng)膜至視皮層傳導的評估,是評價視神經(jīng)損傷的一種重要手段11。本研究通過對損傷前后兔F-VEP的檢測,觀察到使用FPI造成視神經(jīng)損傷后F-VEP主波隱含值較損傷前延長、振幅降低,這與臨床上視神經(jīng)外傷后電生理的變化特征相符。說明使用FPI能夠成功建立外傷性視神經(jīng)損傷的動物模型。本研究經(jīng)過多次預實驗后選取(699·1±70·9)kPa的力量來模擬視神經(jīng)損傷,經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)損傷后的兔行為方式無異常,說明腦組織功能正常。表明研究中選擇

20、的沖擊力不會引起腦組織損傷,但可成功損傷視神經(jīng),且實驗組與對照組損傷后F-VEP P100波隱含值變化差異有統(tǒng)計學意義(P<0·05),說明該力量可以用于兔外傷性視神經(jīng)損傷模型的制作。本研究中損傷后1 d實驗組與對照組P100波隱含值的延長和振幅的降低與損傷前相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0·05)。VEP隱含值反映視神經(jīng)髓鞘的傳導功能,而振幅反映軸索的傳導功能12。說明打擊不僅造成了視神經(jīng)髓鞘的損傷同時也造成了軸突的損傷。而觀察視神經(jīng)損傷后的變化過程,可以發(fā)現(xiàn)損傷后VEP的變化趨勢并非一成不變,許多研究者認為視神經(jīng)不完全損傷過程事實上是視神經(jīng)原發(fā)性、繼發(fā)性損傷與

21、自我修復之間的一種平衡過程13-14。通過實驗組與對照組VEP結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn),損傷后早期實驗組與對照組視神經(jīng)的功能均逐漸下降,隨著時間的延長, 2組視神經(jīng)的功能均有不同程度的恢復,但實驗組較對照組恢復得快且幅度較大,說明晶狀體損傷對視神經(jīng)的修復有促進作用。Leon等15將晶狀體損傷對視神經(jīng)修復的促進作用歸功于單核/巨噬細胞浸潤。這可能與損傷早期實驗組活化的單核/巨噬細胞發(fā)揮以下幾方面的作用有關: (1)吞噬作用,能清除抑制軸突再生的物質(zhì),如髓鞘碎片、膠質(zhì)瘢痕等。(2)載脂蛋白E,參加脂類代謝并參與膜的重建。(3)直接或誘導神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌生長因子與細胞因子16,從而在損傷后期促進視神經(jīng)軸突的再生。這也是視功能趨于穩(wěn)定并有恢復趨勢的主要原因