生物藥物分析與檢驗酶分析法

1、酶酶 分分 析析 法法教學目的和要求教學目的和要求 l熟悉：熟悉： 1酶活力的測定方法酶活力的測定方法 2酶法分析的測定方法酶法分析的測定方法l了解：酶分析法的原理了解：酶分析法的原理概概 述述l1.酶的概念酶的概念是生物體內產生并具有催化活是生物體內產生并具有催化活性的性的一類蛋白質一類蛋白質，由于表現出特異的催化，由于表現出特異的催化功能，因此酶被稱為生物催化劑。功能，因此酶被稱為生物催化劑。l2.酶的應用酶的應用：在體外進行催化反應：在體外進行催化反應l用以制造某些產品用以制造某些產品l用以去除某些物質用以去除某些物質l用以識別某種化合物用以識別某種化合物 屬于屬于“酶分析法酶分析法”l

2、用以測定某種物質用以測定某種物質l酶是由酶是由活細胞活細胞產生的具有產生的具有催化作用催化作用的特殊物質，的特殊物質，又稱又稱生物催化劑生物催化劑。l除極個別除極個別RNARNA為催化自身反應的酶外，其余所為催化自身反應的酶外，其余所有的酶都是有的酶都是蛋白質蛋白質。l生物體內生物體內一切生化反應一切生化反應都需要酶的催化才能進都需要酶的催化才能進行！行！l性能遠遠超過人造催化劑。性能遠遠超過人造催化劑。l產物（產物（productproduct，P P）l底物（底物（substratesubstrate，S S ）酶酶 的的 概概 念念酶是特殊的催化劑酶是特殊的催化劑 (1) (1) 生物大

3、分子生物大分子 (2) (2) 催化條件溫和催化條件溫和 (3) (3) 強酸、堿或高溫下失活強酸、堿或高溫下失活 (3) (3) 高選擇性高選擇性 (4) (4) 高催化效率高催化效率機理：降低反應活化能，提高反應速度，不改機理：降低反應活化能，提高反應速度，不改 變平衡點。變平衡點。只起催化作用，本身不消耗。只起催化作用，本身不消耗。酶酶 的的 特特 點點 概概 括括 如如 下下 ：概概 述述l3.酶分析法包括兩種類型酶分析法包括兩種類型：l一是以酶作為一是以酶作為分析對象分析對象，這類分析方法稱，這類分析方法稱為為“酶活力測定酶活力測定”。l二是以酶作為二是以酶作為分析手段分析手段，用以

4、測定樣品中，用以測定樣品中用一般化學方法難于檢測的物質，通常將用一般化學方法難于檢測的物質，通常將這類分析方法稱為這類分析方法稱為“酶法分析酶法分析”；4.兩類酶分析法的區(qū)別兩類酶分析法的區(qū)別l相同：從原理到方法相同：從原理到方法l不同：不同： 酶活力測定法中酶活力測定法中，是以酶為分析是以酶為分析對象對象。使用的使用的底物底物應該應該過量過量。l酶法分析中酶法分析中，是以酶為分析是以酶為分析工具工具或分析或分析試試劑劑, ,被檢化合物（如：被檢化合物（如：底物底物）是反應的限是反應的限制因素制因素酶法分析的優(yōu)點酶法分析的優(yōu)點1 用于復雜組分中結構或物理化學性質比較相近的同類物質的分離鑒定和分

5、析。2 特異性強、干擾少、操作簡單、樣品和試劑用量少，測定快速精確，靈敏度高等特點。3 通過了解酶對底物的特異性，可以預料可能發(fā)生的干擾反應并設法糾正。4 可用偶聯(lián)反應。5 無污染或污染很少的分析方法。n共同點：原理和方法相同，以酶的專一高效催化某化學反應為基礎，通過測定酶反應的速率或生成物濃度來檢測相應物質的含量。第一節(jié)第一節(jié) 酶活力測定法酶活力測定法l 一、基本概念一、基本概念 l 二、酶促反應的條件二、酶促反應的條件l 三、酶活力的測定方法三、酶活力的測定方法l 四、測定過程中應注意的問題四、測定過程中應注意的問題 一、基本概念一、基本概念l1.酶活力酶活力：指酶催化一定化學反應的能力。

6、：指酶催化一定化學反應的能力。l2.酶活力的測定：酶活力的測定：是測定一個被酶所催化是測定一個被酶所催化的化學反應的速度。的化學反應的速度。l3.酶活力測定的目的：酶活力測定的目的：通過酶反應速度的通過酶反應速度的測定，求得酶的濃度或含量測定，求得酶的濃度或含量酶活力酶活力(enzyme activity)(enzyme activity)的測定的測定 l酶活力是指酶催化某一化學反應的能力，l酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學反應的反應速率來表示，酶催化的反應速率愈大，酶的活力愈高；反應速率愈小，酶的活力就愈低。兩者呈線性關系。l所以測定酶的活力就是測定酶促反應的速測定酶的活力就是

7、測定酶促反應的速率率。 l酶催化的反應速率反應速率可用單位時間內底物的減少量或產物的增加量來表示。l在實際酶活測定中一般以測定產物的增加量為準。lV = p / t p = v t P 0 X 時時 間間 TV V0 0V VX X產產物物濃濃度度引起酶促反應速率降低的原因引起酶促反應速率降低的原因l(1)底物濃度的降低；l(2)產物濃度增加加速了逆反應的進行；l(3)產物對酶的抑制或激活作用l(4)隨著時間的延長引起酶本身部分分子失活等。l因此測定酶活力，應測定酶促反應的初速率，反應初速率與酶量呈線性關系，因此可以用初速率來測定制劑中酶的含量。 檢驗酶反應和測定系統(tǒng)是否適宜的標準檢驗酶反應和

8、測定系統(tǒng)是否適宜的標準l測得的測得的反應速度反應速度必須和必須和酶濃度酶濃度間有間有線線性的比例關系性的比例關系一、基本概念一、基本概念l4.酶反應的速度：酶反應的速度：用單位時間內反應底物用單位時間內反應底物的減少或產物的增加來表示，酶反應的速的減少或產物的增加來表示，酶反應的速度愈快所表示的酶活力愈高。度愈快所表示的酶活力愈高。l5.測定酶活力的方法測定酶活力的方法：可用物理法、化學：可用物理法、化學法或酶分析法等方法。法或酶分析法等方法。一、基本概念一、基本概念l6.常用的酶分析法常用的酶分析法l第一，終點法第一，終點法l第二，取樣測定法第二，取樣測定法l第三，連續(xù)測定法第三，連續(xù)測定法

9、一、基本概念一、基本概念l7.酶的活性單位（國際單位酶的活性單位（國際單位U）：在：在25及最及最適條件下，每分鐘能轉化一個微摩爾適條件下，每分鐘能轉化一個微摩爾(mol)底底物的酶量定為一個活性單位。物的酶量定為一個活性單位。l8.酶的比活性：酶的比活性：為一毫克為一毫克(mg)酶的活性單位數酶的活性單位數目。目。 國際酶活力單位國際酶活力單位l1961年,國際生物化學協(xié)會酶學委員會提出采用統(tǒng)一的“國際單位”(U)來表示酶活力，規(guī)定規(guī)定為：在最適反應條件(溫度25)下，每分鐘內催化1微摩爾(umo1)底物轉化為產物所需的酶量,定為一個酶活力單位，即l 1 U = 1 umol1 U = 1

10、umolminmin。 酶的比活力酶的比活力(specific activity)(specific activity)l比活力比活力: :每mg蛋白質所含的酶活力單位數表示，l比活力=活力Umg蛋白=總活力U/總蛋白mgl有時用每g酶制劑或每m1酶制劑含有多少個活力單位來表示(Ug或Uml)。l比活力大小的含義：比活力大小的含義：可用來比較每單位質量蛋白質的催化能力。比活力愈大，表示酶的純度愈高?；盍挝换盍挝? ( ) )與比活力與比活力lU U速度單位速度單位11l酶產品質量評價中常使用比活力酶產品中酶活力稱酶產品中酶活力稱比活力比活力。l u/mgu/mg酶蛋白酶蛋白 u/mlu/m

11、l酶蛋白酶蛋白l國際單位（國際單位（IUIU）：在實驗規(guī)定的條件下（）：在實驗規(guī)定的條件下（2525，最適最適pHpH、最適底物濃度時），、最適底物濃度時），1ul1ul標本，以每標本，以每分鐘能催化分鐘能催化1 1微摩爾底物的酶量為微摩爾底物的酶量為1 1個國際單位。個國際單位。酶促反應速度的測定方法酶促反應速度的測定方法 P 0 X 時時 間間 TV V0 0V VX X產產物物濃濃度度提問：提問：為什么反應速度會隨為什么反應速度會隨時間減小？時間減小？答案：答案：1.S降低；降低； 2.酶受到產物抑制酶受到產物抑制提問：提問：用哪一個速度來表示用哪一個速度來表示該酶促反應的速度特征呢？該

12、酶促反應的速度特征呢？反應反應初初速度表示酶活力。速度表示酶活力。提問：提問：僅用反應初速度大小對比酶活力行嗎？僅用反應初速度大小對比酶活力行嗎？答案答案：不行，不行，還與酶的加入量及條件有關。還與酶的加入量及條件有關。酶活力測定實例酶活力測定實例l首先首先 確定反應條件確定反應條件 20、pH=7，底物濃度，底物濃度 6g/l（過（過量），加入量），加入2mg固體脂肪酶固體脂肪酶l第二第二 確定活力單位確定活力單位 如每小時催化如每小時催化1 1克底物克底物 1u= 1g/hl第三第三 測算反應初速度測算反應初速度 作產物甘油隨時間增加的曲線，作產物甘油隨時間增加的曲線，量出反應初速度值量出

13、反應初速度值 ，換算為脂肪的消耗速度，換算為脂肪的消耗速度 如如 8g/hl第四第四 換算活力換算活力 8g/h 1g/h=8ul第五第五 計算比活計算比活 8u/2mg酶蛋白酶蛋白=4u/mg酶蛋白酶蛋白脂肪酶脂肪酶二、酶促反應的條件二、酶促反應的條件l基本要求基本要求：l反應系統(tǒng)中除了反應系統(tǒng)中除了待測酶的濃度待測酶的濃度是影響速度是影響速度的的惟一因素惟一因素外，其他因素都處于最適于酶外，其他因素都處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平。發(fā)揮催化作用的水平。 確定反應條件時應考慮確定反應條件時應考慮： （1）底物底物 選用的底物在物理化學性質上選用的底物在物理化學性質上和產物不同和產物不同。 一

14、般選用底物的濃度一般選用底物的濃度S=100 Km 一般選擇一般選擇Km小的作測定的底物。小的作測定的底物。 l（2）pH值值 注意選擇適宜的反應注意選擇適宜的反應pH值，值，并將反應維持在這一并將反應維持在這一pH值。值。l例：丙酮酸例：丙酮酸 乳酸乳酸乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶pHpH對酶反應的影響對酶反應的影響 pHpH影響酶活力的原因影響酶活力的原因 l(1) 過酸或過堿可以使酶的空間結構破壞，引起酶構象的改變，酶活性喪失。l(2) 當pH改變不很劇烈時，酶雖未變性，但活力受到影響。l影響了底物的解離狀態(tài)；l影響酶分子活性部位上有關基團的解離；l影響到中間絡合物ES的解離狀態(tài)，不利于催化生成

15、產物。二、酶促反應的條件二、酶促反應的條件 （3）溫度溫度 實驗中溫度變動應控制在實驗中溫度變動應控制在0.1以內。酶反應的溫度通常選用以內。酶反應的溫度通常選用25、30、37。 （4）輔助因子輔助因子 為了提高酶在反應系統(tǒng)中為了提高酶在反應系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應的物質。的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應的物質。 最適溫度最適溫度 機理：機理：溫度導溫度導致酶蛋致酶蛋白變性白變性溫度對酶反應的影響溫度對酶反應的影響溫度對酶反應的影響溫度對酶反應的影響l在最適溫度之前，一般溫度越高，反應速度就越快。l酶的固體狀態(tài)比在溶液中對溫度的耐受力要高。通常酶制劑以固體保存為佳。（5）空白和對照空白

16、和對照 空白空白 指雜質反應和自發(fā)反應引起的變化量，指雜質反應和自發(fā)反應引起的變化量，提提供未知因素的影響供未知因素的影響 對照對照作為比較或標定的作為比較或標定的標準標準。三、酶活力的測定方法三、酶活力的測定方法l按取樣及檢測的方式按取樣及檢測的方式l（一）取樣測定法（一）取樣測定法l（二）連續(xù)測定法（二）連續(xù)測定法（一）取樣測定法（一）取樣測定法l1.取樣測定法：取樣測定法：求得單位時間內酶促求得單位時間內酶促反應變化量的方法。反應變化量的方法。 l2.常用的檢測方法常用的檢測方法：紫外：紫外-可見分光可見分光光度法、熒光分析法等。光度法、熒光分析法等。取樣測定法取樣測定法 在酶反應開始后

17、不同的時間，從反應系統(tǒng)在酶反應開始后不同的時間，從反應系統(tǒng)中取出一定量的反應液，并用適當的方法中取出一定量的反應液，并用適當的方法（添加酶的變性劑或使酶失活）停止其反（添加酶的變性劑或使酶失活）停止其反應后，再根據產物和底物在化學性質上的應后，再根據產物和底物在化學性質上的差別，選用適當的檢測方法進行定量分析，差別，選用適當的檢測方法進行定量分析，求得單位時間內酶促反應變化量的方法。求得單位時間內酶促反應變化量的方法。取樣測定法取樣測定法取樣測定法一直沿襲至今是因為：取樣測定法一直沿襲至今是因為：l不需要特殊儀器不需要特殊儀器l幾乎所有酶反應都可根據產物或底幾乎所有酶反應都可根據產物或底物的化

18、學性質找出具體的測定方法物的化學性質找出具體的測定方法l由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來的底物分子上接上相應的可在原來的底物分子上接上相應的有色基團、發(fā)色基團或熒光基團。有色基團、發(fā)色基團或熒光基團。l3、終止酶反應：、終止酶反應：添加酶的變性劑添加酶的變性劑l三氯醋酸：紫外光區(qū)有吸收三氯醋酸：紫外光區(qū)有吸收l高氯酸：對酸和氧化劑敏感的對象不適用高氯酸：對酸和氧化劑敏感的對象不適用l4、特點：、特點：l不需要特殊儀器不需要特殊儀器l容易找到具體測定方法容易找到具體測定方法l色源底物和熒光源底物發(fā)展快色源底物和熒光源底物發(fā)展快 （二）連續(xù)測定法（二）連續(xù)測

19、定法l1.連續(xù)測定法連續(xù)測定法：基于底物和產物在：基于底物和產物在物理化物理化學性質上的不同學性質上的不同，在反應過程中對反應系，在反應過程中對反應系統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測的方法。統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測的方法。l2.常用的檢測方法常用的檢測方法連續(xù)測定法連續(xù)測定法l基于底物和產物在物理化學性質基于底物和產物在物理化學性質上的不同，在反應過程中對反應上的不同，在反應過程中對反應系統(tǒng)進行連續(xù)檢測的方法。系統(tǒng)進行連續(xù)檢測的方法。 連續(xù)測定法的準確性和測定效率連續(xù)測定法的準確性和測定效率比較好比較好酶活不能反映酶的使用效果 只能用于產品質量的控制測定過程中應注意的問題測定過程中應注意的問題l產物的測定l反應速

20、度的測定l測定要達到的要求酶反應進程曲線酶反應進程曲線01 12 23 34 45 56 60 05 5101015152020t/minc/mg/mLc/mg/mL5040302010酶量酶量酶濃度曲線的關系酶濃度曲線的關系0 00.10.10.20.20.30.30.40.40.50.50.60.60 0101020203030404050506060酶量酶量反應速率反應速率t=15t=10t=5t/min酶分析法的檢測方法酶分析法的檢測方法l最常用的方法介紹如下：最常用的方法介紹如下：l(1) (1) 紫外紫外- -可見分光光度法可見分光光度法l(2) (2) 熒光分析法熒光分析法l(3

21、) (3) 旋光度法旋光度法l(4) (4) 酶偶聯(lián)測定法酶偶聯(lián)測定法l(5) (5) 其他檢測法其他檢測法酶分析法的檢測方法酶分析法的檢測方法一、紫外一、紫外- -可見分光光度法可見分光光度法 NADNAD+ + ( (煙酰胺煙酰胺- -腺嘌呤二核苷酸，又稱為輔腺嘌呤二核苷酸，又稱為輔酶酶I) I) 和和NADPNADP+ +( (煙酰胺煙酰胺- -腺嘌呤磷酸二核苷酸腺嘌呤磷酸二核苷酸, ,又稱為輔酶又稱為輔酶II )II )是維生素煙酰胺的衍生物，是維生素煙酰胺的衍生物，OCH2OPOPOCH2OHOHO OO-O-N+CONH2OOHOH(OPO3H2)NNNH2NNNNH2ORNH2O

22、RNC+C還原還原氧化氧化NAD+NADH在在338.5nm338.5nm與與340.5nm340.5nm之之間有一個最大吸收峰間有一個最大吸收峰300-400nm300-400nm無吸收無吸收丙酮酸丙酮酸+NADH+H+NADH+H+ +LDH乳酸乳酸+NAD+NAD+ +例例 1、例例 2、天冬氨酸天冬氨酸+ +a-草酰酮戊二酸草酰酮戊二酸谷氨酸谷氨酸+ +草酰乙酸草酰乙酸GOT草酰乙酸草酰乙酸+NADH+H+NADH+H蘋果酸蘋果酸+NAD+NAD+ +MDH酶偶聯(lián)測定法酶偶聯(lián)測定法：是應用過量、高度專一的：是應用過量、高度專一的“偶聯(lián)工具酶偶聯(lián)工具酶”使被測酶反應能連續(xù)進行到某一可使被

23、測酶反應能連續(xù)進行到某一可直接、連續(xù)、簡便、準確測定階段的方法。直接、連續(xù)、簡便、準確測定階段的方法。被測反應被測反應G+ATPG-6-P+ADPHKG-6-P+NADPNADPH+6-P-GCOOHG6PDH偶聯(lián)指示反應偶聯(lián)指示反應被測反應被測反應AMP+ATP2ADP肌激酶肌激酶輔助反應輔助反應ADP+PEPATP+Pyr丙酮酸激酶丙酮酸激酶指示反應指示反應Pyr+NADH+H+L+NAD+乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶二、熒光分析法二、熒光分析法三三 華勃氏呼吸儀檢壓法華勃氏呼吸儀檢壓法四、放射性同位素測定法四、放射性同位素測定法華勃氏微量呼吸儀（瓦氏呼吸儀）華勃氏微量呼吸儀（瓦氏呼吸儀） 五五

24、電化學法（電化學法（electrochemicalelectrochemical）lpHpH測定法：測定法：用高靈敏度的pH計，跟蹤反應過程中H+變化的情況，用pH的變化來測定酶的反應速率。l離子選擇電極法：離子選擇電極法：測定某些酶的酶活力，用氧電極可以測定一些耗氧的酶反應，如葡糖氧化酶的活力就可用這個方法很方便地測定。 第二節(jié)第二節(jié) 酶法分析酶法分析l 一、終點測定法一、終點測定法 l 二、反應速度法二、反應速度法 一、原理一、原理是在以待測物質為底物的酶反應中，如果是在以待測物質為底物的酶反應中，如果能使底物能夠接近完全地轉化為產物，而能使底物能夠接近完全地轉化為產物，而且底物或產物又具

25、有某種特征性質，通過且底物或產物又具有某種特征性質，通過直接測定轉化前后底物的減少量，產物的直接測定轉化前后底物的減少量，產物的增加量或輔酶的變化就可以定量待測物增加量或輔酶的變化就可以定量待測物平衡法平衡法 l用于復雜組分中結構或物理化學性質比較用于復雜組分中結構或物理化學性質比較 相近的同類物質的相近的同類物質的分離鑒定和分析分離鑒定和分析。l特異性強、干擾少、操作簡單、樣品和試特異性強、干擾少、操作簡單、樣品和試 劑用量少，測定快速精確，靈敏度高等特劑用量少，測定快速精確，靈敏度高等特 點。點。l通過了解酶對底物的特異性，可以預料可能通過了解酶對底物的特異性，可以預料可能 發(fā)生的干擾反應

26、并設法糾正。發(fā)生的干擾反應并設法糾正。l可用偶聯(lián)反應?？捎门悸?lián)反應。l無污染或污染很少的分析方法。無污染或污染很少的分析方法。優(yōu)優(yōu) 點點 ：一、終點測定法一、終點測定法l1.原理原理：先借助酶反應（單獨的反應或幾種酶：先借助酶反應（單獨的反應或幾種酶構成的偶數酶反應）使被測物質定量地進行轉構成的偶數酶反應）使被測物質定量地進行轉變，然后在轉化完成后，變，然后在轉化完成后，測定底物、產物或輔測定底物、產物或輔酶物質（第二底物）等的變化量酶物質（第二底物）等的變化量。l2.一般采用的測定方法：一般采用的測定方法：l光吸收、熒光之類的分光光度法光吸收、熒光之類的分光光度法l測定氣體產生與吸收的測壓量

27、氣法（華勃氏測定氣體產生與吸收的測壓量氣法（華勃氏呼吸儀檢壓法）呼吸儀檢壓法）l檢知檢知pH值變化的滴定法值變化的滴定法l同位素跟蹤測定法同位素跟蹤測定法（一）終點法條件（一）終點法條件 l 1酶的底物特異性（專一性）酶的底物特異性（專一性）：具有高度的：具有高度的底物專一性，有一些酶是呈族特異性；底物專一性，有一些酶是呈族特異性； l 2反應的平衡反應的平衡 ：l酶反應若平衡十分偏向進行方向，則可方便地酶反應若平衡十分偏向進行方向，則可方便地用終點測定法檢測；用終點測定法檢測；l但若反應的平衡并不十分偏向進行方向，或者但若反應的平衡并不十分偏向進行方向，或者偏向逆方向，此時由于反應不能完全，

28、因而反偏向逆方向，此時由于反應不能完全，因而反應就不能正確定量，解決這一問題，通?？刹蓱筒荒苷_定量，解決這一問題，通?？刹扇∫恍┐胧?。取一些措施。 反應的平衡反應的平衡谷氨酸谷氨酸+ +NAD+H2Oa-酮戊二酸酮戊二酸+NADH+NH+谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶NADH+丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸+ NAD+乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶l 3反應液中的酶量反應液中的酶量 ：要使酶反應在短時間內：要使酶反應在短時間內完成，只有使用對底物親和性很大的酶（即完成，只有使用對底物親和性很大的酶（即Km要?。赣昧浚匆。赣昧浚碫max）必須大才能達到此）必須大才能達到此點。工作中，在點。工作中，在10

29、min內反應完成內反應完成99%，則常，則常數數K以以1.0min-1為宜。為宜。l 4反應產物抑制：反應產物抑制：如果產物對反應本身有抑如果產物對反應本身有抑制作用，則會妨礙反應進行，在這種情況下可制作用，則會妨礙反應進行，在這種情況下可將該產物除去或者和再生系統(tǒng)偶聯(lián)等辦法解決。將該產物除去或者和再生系統(tǒng)偶聯(lián)等辦法解決。 反應產物抑制反應產物抑制S+ATPP+ADP丙酮酸丙酮酸丙酮酸激酶丙酮酸激酶磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸S激酶激酶（二）終點法種類（二）終點法種類l1單酶反應定量法：單酶反應定量法：（1）底物減少量的測定底物減少量的測定：在以待測物質為：在以待測物質為底物的酶反應中，如

30、果底物能接近完全地底物的酶反應中，如果底物能接近完全地轉化為產物，且又具有某種特征性質（例轉化為產物，且又具有某種特征性質（例如特征的吸收譜帶）時，則就可能簡便地如特征的吸收譜帶）時，則就可能簡便地通過直接測定底物的減少量，而定量待測通過直接測定底物的減少量，而定量待測物。物。 （二）終點法種類（二）終點法種類（2）產物增加量的測定產物增加量的測定：在以被測物為底：在以被測物為底物的酶的反應中，如果底物基本上都能轉物的酶的反應中，如果底物基本上都能轉變?yōu)楫a物，而產物又具有可以專一地進行變?yōu)楫a物，而產物又具有可以專一地進行定量測定的性質，那么根據產物增加就能定量測定的性質，那么根據產物增加就能檢

31、知底物的量。檢知底物的量。（3）輔酶變化量的測定輔酶變化量的測定：以：以NAD或或NADP為輔酶的脫氫酶反應，通過測定為輔酶的脫氫酶反應，通過測定340nm吸收度的變化，就能對作為相應脫氫酶底吸收度的變化，就能對作為相應脫氫酶底物的物質進行定量分析。物的物質進行定量分析。 1. 羥基丙酮酸的定量測定羥基丙酮酸的定量測定羥基丙酮酸羥基丙酮酸+NADH+H+NADH+HDD甘油酸甘油酸+NAD+NAD+ +L-L-谷氨酸谷氨酸+NAD+NAD+ +H+H2 2O O甘油酸甘油酸脫氫酶脫氫酶2. L-2. L-谷氨酸谷氨酸的定量測定的定量測定a-酮戊二酸酮戊二酸+NADH+NH+NADH+NH4 4

32、+ +谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶l2和指示酶反應偶聯(lián)的定量法和指示酶反應偶聯(lián)的定量法（1）以脫氫酶為指示劑以脫氫酶為指示劑：用來作為偶聯(lián)指：用來作為偶聯(lián)指示劑的酶中應用得最廣泛的是以示劑的酶中應用得最廣泛的是以NAD或或NADP為輔酶的脫氫酶類為輔酶的脫氫酶類 （2）以脫氫酶以外的酶作指示劑以脫氫酶以外的酶作指示劑：參與某：參與某些色素氧化還原的酶中有的可用作指示劑，些色素氧化還原的酶中有的可用作指示劑，反應的進行可由吸收度的變化來測定。反應的進行可由吸收度的變化來測定。 2 2、和指示酶反應偶聯(lián)的定量法、和指示酶反應偶聯(lián)的定量法以脫氫酶為指示劑以脫氫酶為指示劑1-1-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖

33、6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖磷酸葡萄糖變位酶磷酸葡萄糖變位酶1 1，6-6-二磷酸葡萄糖二磷酸葡萄糖6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖+NADP+NADP6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸+NADPH+H+NADPH+H+ +6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖脫氫酶葡萄糖脫氫酶D-2-D-2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶烯醇化酶磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸+ADP+ADP丙酮酸激酶丙酮酸激酶丙酮酸丙酮酸+ATP+ATP丙酮酸丙酮酸+NADH+H+NADH+H+ +乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶乳酸乳酸+NAD+NAD+ +以脫氫酶以外的酶為指示劑以脫氫酶以外的酶為指示

34、劑D-D-葡萄糖的定量測定葡萄糖的定量測定葡萄糖葡萄糖葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸+H+H2 2O O2 2H H2 2O O2 2 +4-+4-氨基安替比林酚氨基安替比林酚醌亞膠色素醌亞膠色素+4H+4H2 2O O葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶過氧化物酶過氧化物酶二、反應速度法二、反應速度法反應速度法反應速度法是在一定條件下（一定是在一定條件下（一定pHpH值和值和溫度），測定反應的初速度，而反應的初溫度），測定反應的初速度，而反應的初速度與被測物質的濃度成正比關系，因此速度與被測物質的濃度成正比關系，因此可根據初速度計算被測物質的量，也可利可根據初速度計算被測物質的量，也可利用標準品對照法計算被測物質的量。用標準品對照法計算被測物質的量。特特 點點 ：測定速度快測定速度快試劑用量少試劑用量少成本低成本低對濁度和色素的干擾不敏感對濁度和色素的干擾不敏感不需要考慮反應是否進行完全不需要考慮反應是否進