腎綜合征出血熱患者尿沉渣細胞中病毒RNA的檢測

1、    腎綜合征出血熱患者尿沉渣細胞中病毒RNA的檢測        【摘要】目的進一步闡明病毒在腎綜合征出血熱腎臟損害中的作用。方法應(yīng)用套式-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)對31例腎綜合征出血熱患者79份尿液沉渣細胞中病毒核酸進行檢測。結(jié)果79份樣本中58份陽性，陽性率為73.4%在病程早期(17天)各型患者的檢出率為100%；在病程后期(13天)，輕、中、重型患者的檢出率分別為0%、16%和85%，重型患者的檢出率較中型、輕型患者高(P<0.01,P<0.05)；且檢出

2、率與腎功能損害密切相關(guān)。結(jié)論早期存在病毒對腎臟有直接損傷作用，在重型患者病毒的直接作用為腎臟損害的主要因素?！娟P(guān)鍵詞】腎綜合征出血熱聚合酶鏈反應(yīng)Detection of virus RNA in urinary sediments of the patients with hemorrhagic fever with renal syndrome Zhang Fan, Yue Jinsheng, Fan Wanhu, et al. Department of Infectious Diseases, the First Clinical Medical College, Xian Medica

3、l University, Xian 710061【Abstract】ObjectiveIn order to explore direct cytopathic effect of HFRS virus to kidney in the patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS). MethodsWe detected HFRSV RNA in urinary sediments of 79 samples from 31 HFRS patients by nested reverse transcription po

4、lymerase chain reaction (nested RT-PCR). ResultsHFRSV RNA in 58 of 79 (73.4%) samples were posive. During the early stage of HFRS (17days), HFRSV RNA were detected in all samples (100%). During the late stage of HFRS(13days), the posive ratio of HFRSV RNA in mild moderate and serious patients were 0

5、%, 16% and 85% respectively. The HFRSV RNA were detected more often in the serious patients with HFRS than that in the mild and moderate patients (P<0.01,P<0.05).The detection rate of HFRSV RNA was correlated with the level of renal impairment. ConclusionIt suggested that there is direct cytop

6、athic effect of HFRSV virus on kidney, which seems to be the major pathogenic factor in serious patient and the impairment of renal functions may occur in the early stage.【Key words】Hemorrhagic fever with renal syndromePolymerase chain reaction我們用套式-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Nested-RT-PCR)對腎綜合征出血熱患者尿沉渣中的病毒核酸(HFRSV

7、 RNA)進行了系列、動態(tài)檢測，進一步探討了該病毒在腎臟損害中的作用。對象與方法一、研究對象79份HFRS患者尿標本均采自西安幾所醫(yī)院住院31例患者，其中男26例，女5例；年齡1668歲，平均34歲。按1986年南京全國出血熱臨床學術(shù)會議制定的標準進行診斷及分型，其中輕型5例，中型9例，危、重型17例。血清HFRS特異性抗體檢測均陽性，HFRSV RNA 均陽性。二、研究方法(一) 尿沉渣提取尿液標本取HFRS患者新鮮尿液5ml,2 000r/min離心10分鐘，棄上清，沉淀物置-20°C保存。20份非HFRS患者(系膜IgA腎病2份，腎小球腎炎10份，尿毒癥8份)及正常人尿液10份

8、亦按上述方法分離出尿沉渣，同樣保存。(二) 尿沉渣細胞中HFRSV RNA的提取將上述提取的尿沉渣PBS洗滌3次置于雙蒸水75l中，加入裂解液(4mol/L異硫氰酸胍、10%十二烷基磺酸鈉、3mol/L NaAc、0.5mol/L EDTA與等體積水飽和酚混合)，混勻后加入氯仿與異戊醇(241)50l,室溫離心 15 000r/min 5分鐘，取上清100l，二倍體積預冷無水乙醇-20°C沉淀30分鐘，75%預冷乙醇洗滌，60°C烘干，直接在試管中進行反轉(zhuǎn)錄及第一次PCR擴增。(三) 引物設(shè)計根據(jù)Kim等1報道的互補于HFRSV S片段2，3、型和型通用引物序列，引物由上海

9、細胞生物研究所合成。其序列如下：SK1 5-ATTGATGAACCTACAGGA C-3，SK2 5-AGCATGAAGGCAGAAGA G-3，SK3，5-ACAAGCATGTTGGTGGA C-3，SK4 5-TGTATCCCCATTGATTGT G-3，其中SK1、SK4為外引物，SK2、SK3為內(nèi)引物。(四) cDNA合成及第一次PCR擴增試劑均購自Promega公司。向上述已提取RNA管內(nèi)加入10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2l、2.5mol dNTP 1.6l、正、反向外引物各25pmol/L、RNasin 10u、AMV2u、Taq酶0.5u，用石蠟油20l覆蓋。42°C水

10、浴30分鐘，然后放入DNA循環(huán)儀進行如下30次循環(huán)：94°C30秒，55°C30秒，72°C30秒。(五) 第二次PCR擴增取第一次PCR產(chǎn)物1l，向其中加入10×PCR緩沖液2l、2.5mol dNTP 1.6l、正向及反向內(nèi)引物各25pmol/L、Taq酶0.5u，用石蠟油20l覆蓋。在DNA循環(huán)儀上按94°C30秒，55°C30秒，72°C30秒進行30次循環(huán)。取擴增產(chǎn)物10l在1.5%瓊脂糖凝膠中做電泳，以標準分子量為參考，在紫外透視儀下觀察，在403bp處顯現(xiàn)熒光者為陽性。結(jié)果一、HFRS患者尿沉渣細胞中HFRSV

11、 RNA的檢出31例患者79份尿沉渣細胞中的HFRSV RNA的檢出率為73.4%，其中發(fā)病17天為100%(見表1)。20份非HFRS患者及10份正常人尿標本檢測均為陰性(見附)。二、HFRS患者尿沉渣細胞中HFRSV RNA在不同病型HFRS患者中的檢出情況     附14,78為陽性結(jié)果；6為陰性結(jié)果；9為陰性對照；10為空白對照；5為標準分子量DNA Hind+EcoRI 見表2。17病日，輕、中、重型患者尿沉渣細胞中均可檢出HFRSV RNA； 812病日，輕、中型患者檢出率開始下降，重型與中型、重型與輕型患者之間檢出率出現(xiàn)明顯差異，分別P&l

12、t;0.01和P<0.05，而中型與輕型患者之間檢出率無差別，P>0.05。表1HFRS患者不同病程尿沉渣細胞中HFRSV RNA的檢出率病程(天)總例數(shù)陽性例數(shù)陽性率(%)1722221008122117811322231461>2213538.5合計795873.4     表2不同病型HFRS患者尿沉渣細胞中HFRSV RNA的檢出率病程(天)輕型中型重、危重型總例數(shù)陽性例數(shù)總例數(shù)陽性例數(shù)總例數(shù)陽性例數(shù)17445513138124264111113401222017     三、尿沉渣細胞中

13、HFRSV RNA的檢出率與腎臟損害的關(guān)系以尿蛋白的量為判斷腎功能損傷的指標，尿蛋白陰性組、輕度增高組和重度蛋白尿組的檢出率分別為33.3%、76.3%和100%，各組之間P值分別為P<0.01、P<0.01和P<0.05。同時尿沉渣細胞HFRSV RNA陽性與陰性組之間血清BUN值有明顯差別(36.04±4.32,13.67±4.22,P<0.05)。 討論通過對31例HFRS患者79份系列尿標本的動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，早期(17天)患者尿沉渣細胞中HFRSV RNA的檢出率為100%，隨著病程的進展檢出率逐漸下降。在不同病型的患者中，輕、中型患者的檢出率

14、隨病程增長明顯下降，而重型患者下降幅度不大。在病程后期(13天)重癥患者的檢出率遠較中型與輕型患者高，說明尿沉渣細胞中HFRSV RNA存在的時間與病型輕重有密切的關(guān)系。通過對腎功能損害臨床指標觀察，尿沉渣細胞中HFRSV RNA的檢出率與腎損害的程度成正比。以上結(jié)果表明，在發(fā)病早期(17天)，此時患者多處于發(fā)熱、低血壓休克期，臨床上患者多突然出現(xiàn)大量蛋白尿、血尿和腎功能損害，可能為病毒對腎組織的直接損害48。重型患者在病程后期，尤其是在13病日以后，檢出率明顯高于輕、中型患者，此時多數(shù)患者處于多尿及恢復期，有二例重型患者在第30病日以上仍可在其尿沉渣細胞中檢出HFRSV RNA，表明在重癥患者病程后期，病毒仍對腎臟有損害作用?？赡苁桥R床重型患者多尿期二次腎衰及腎損害慢性化的主要原因。綜上所述，HFRS患者尿沉渣細胞中HFRSV RNA的檢出率隨病程而下降，說明早期原發(fā)性腎損傷為病毒直接作用所致，檢出率與患者的病情輕重成正相關(guān)，與腎損害程度成正比，表明病毒的直接作用為腎臟損害的主要原因。所