綠色熒光蛋白高表達(dá)動(dòng)物模型的建立及在活體成像中的應(yīng)用

1、綠色熒光蛋白高表達(dá)動(dòng)物模型的建立及在活體成像中的應(yīng)用*        【摘要】     目的 建立綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因標(biāo)記的小鼠Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma,LLC）移植瘤裸鼠模型，利用自行研制的熒光分子成像儀實(shí)時(shí)地觀察腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成及藥物療效的觀察。方法 （1）體外擴(kuò)增穩(wěn)定表達(dá)GFP的LLC腫瘤細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況；（2）LLC-GFP細(xì)胞以濃

2、度為2×106/ml接種裸鼠背部，以建立LLC裸鼠移植瘤模型；（3）分別在接種瘤細(xì)胞2周后，每隔3天對(duì)裸鼠進(jìn)行活體成像1次，觀察腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及局部血管生成情況，同時(shí)給予環(huán)磷酰胺（CTX）10 mg/kg治療并測(cè)定抑瘤率。結(jié)果 （1）培養(yǎng)24 h后，用熒光倒置顯微鏡觀察，可見幾乎所有LLC-GFP細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光；（2）LLC裸鼠移植瘤模型建立后，用波長470 nm的藍(lán)光激發(fā)，通過熒光活體成像儀觀察可見腫瘤發(fā)出綠色熒光；（3）活體成像可見腫瘤的生長呈進(jìn)行性動(dòng)態(tài)變化，4周后可見胸腹腔等廣泛轉(zhuǎn)移，同時(shí)觀察到腫瘤的血管生成和發(fā)展情況，環(huán)磷酰胺組腫瘤大小明顯小于陰性對(duì)照組（P<

3、0.05）。結(jié)論 熒光分子成像的方法可以對(duì)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、血管生成及藥物療效判定等方面進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)地連續(xù)監(jiān)測(cè)，為研究腫瘤提供了新的思路和方法。     【關(guān)鍵詞】  綠色熒光蛋白 分子影像 Lewis肺癌          Development of GFP high-expressing animal model and its application to molecular imaging in vivo    L

4、I Qun,SHEN Bao-zhong,DU Jie.Department of Radiology,Tongji Hospital,Tongji University,Shanghai 200065,China    Abstract  Objective  To develop nude mice model of Lewis lung carcinoma （LLC） expressing green fluorescent protein （GFP） and observe the tumor progression,further m

5、etastasis,angiogenesis and the effect of CTX on tumors in a noninvasive,alive,real-time and sequent way with small animal fluorescent imaging system made by ourselves.Methods  （1）LLC cells stably expressing GFP in vitro were cultured and observed with fluorescent inversion microscope.（2）LLC- GF

6、P cells were harvested and injected subcutaneously on the back of the nude mice at 2×106 cells/ml till transplanted tumors developed.（3）Fluorescence imaging system was used to image mice alive two weeks later and every three days to observe the progression,further metastasis,angiogenesis of loc

7、al tumors and tumor-inhibiting effect of CTX （10 mg/kg）.Results  （1）After cultured for 24h,almost all the LLC- GFP cells emitted bright green fluorescence.（2）Two weeks later observed by fluorescent imaging system,LLC transplanted tumors emitted green fluorescence when activated by 470nm blue li

8、ght.（3） In vivo imaging it suggested that tumors gradually grew up in volume,and there was extensive metastasis four weeks later.The angiogenesis and development of transplanted tumor could be seen,and the average size of tumors in CTX treatment group was smaller than that in control group （P<0.0

9、5）.Also,it could be seen that most tumors emitted green fluorescence which increased with tumor growth without fluorescence attenuation.Conclusion  Fluorescent molecular imaging technique can stably and conveniently monitor tumor growth,metastasis,angiogenesis and treatment effect evaluation of

10、 anticancer drugs in vivo in a real-time and noninvasive way,which provides a new idea and method and plays an important role in tumor research.    Key words  green fluorescent protein;molecular imaging；Lewis lung carcinoma    簡(jiǎn)便、直觀地獲得腫瘤在活體上早期的細(xì)胞和分子生物學(xué)水平的信息，并對(duì)腫瘤治療早

11、期療效進(jìn)行判斷，一直是腫瘤研究的目標(biāo)之一，也是當(dāng)今國際腫瘤研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在分子影像學(xué)成為一個(gè)學(xué)科以前，沒有任何的手段能克服這一難題。    分子影像學(xué)是將分子生物學(xué)與影像學(xué)相結(jié)合，用細(xì)微影像設(shè)備對(duì)活體動(dòng)物的生理及病理過程，從細(xì)胞和分子水平上進(jìn)行影像學(xué)的描述和測(cè)定。這一成像過程主要依靠分子影像探針的介導(dǎo)，使其標(biāo)記的靶細(xì)胞或與之共同表達(dá)的目的基因成像。分子成像技術(shù)分為光學(xué)分子成像、MR分子成像、核素分子成像。其中，光學(xué)分子成像具有一定的優(yōu)勢(shì)，其技術(shù)相對(duì)穩(wěn)定，可應(yīng)用不同影像探針發(fā)出不同波長的熒光來研究不同基因的同時(shí)表達(dá)，與MR分子成像、核素分子成像相比，所用設(shè)備造價(jià)

12、不高，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因是光學(xué)分子成像最常用的報(bào)告基因，利用它標(biāo)記Lewis肺癌移植瘤國際尚未見有報(bào)道，本研究建立荷GFP基因標(biāo)記的小鼠Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma,LLC）移植瘤裸鼠模型，應(yīng)用自行研制的熒光成像儀進(jìn)行活體成像，以無創(chuàng)、實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)地觀察研究腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成及治療效果，以此為國內(nèi)分子影像學(xué)研究做初步的探索。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料  活體熒光

13、成像儀（Macroillumination imaging system and tunable lighting system）為自行研發(fā)；OLYMPUS XT70型熒光倒置顯微鏡，購自日本OLYMPUS公司；BC110型電子天平，購自德國賽多利絲股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，購自Gibco公司，批號(hào)20030810；胰酶，購自Sigma公司，批號(hào)20031110；胎牛血清，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，批號(hào)20030609。其他均為國產(chǎn)試劑純。    1.2  動(dòng)物模型的建立    1.2.1  細(xì)

14、胞培養(yǎng)  小鼠Lewis肺癌（Lewis lung cancer,LLC）和穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的LLC細(xì)胞系（LLC-GFP），均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所凍存。常規(guī)方法使細(xì)胞復(fù)蘇后，將細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液（RPMI-1640加入10小牛血清、青霉素100 u/ml、鏈霉素100 u/ml），置于37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞為半懸浮生長，待覆蓋率為80%左右，消化、傳代。傳代培養(yǎng)24 h后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于熒光倒置顯微鏡下，用470 nm藍(lán)光照射培養(yǎng)瓶進(jìn)行激發(fā)，于高倍鏡下觀察細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，待所有細(xì)胞均發(fā)出

15、明亮的綠色熒光時(shí)即可用于接種于裸鼠。    1.2.2  移植瘤模型的建立  24周雄性裸鼠10只，體重1820 g，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將對(duì)數(shù)生長期的LLC-GFP細(xì)胞消化、收集，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制成2×106/ml的單細(xì)胞懸液，按照0.2 ml/只皮下接種于裸鼠背部。取LLC細(xì)胞，以同樣方法接種于2只雄性裸鼠，作為模型成像的對(duì)照。    1.3  活體成像    1.3.1  腫瘤生長動(dòng)態(tài)成像  腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠后，于第7天、18天、2

16、9天和40天，分別應(yīng)用自行研發(fā)的GFP光學(xué)活體成像儀對(duì)裸鼠進(jìn)行活體成像：用50 W汞燈作為光源，光線聚焦后，經(jīng)470 nm/40帶通濾色片，形成亮度可調(diào)的高亮度藍(lán)色激發(fā)光，經(jīng)光導(dǎo)纖維傳輸形成線形光束。將模型鼠置于黑色背景載物臺(tái)上，高亮度藍(lán)色激發(fā)光照射裸鼠全身，聚焦于瘤體上，通過515 nm/20帶通的濾色片觀察到峰值為508 nm的綠色光。通過CCD數(shù)碼相機(jī)采集圖像，經(jīng)Microfire圖像處理軟件處理成像，圖像分辨率為1600 dpi×1200 dpi。    1.3.2  腫瘤轉(zhuǎn)移的成像  裸鼠移植瘤模型隨機(jī)選取2只，于第40天最

17、后一次成像后，斷髓處死。置于黑色背景載物臺(tái)上，打開470 nm高亮度藍(lán)色激發(fā)光源，透過515 nm/20帶通的濾色片觀察，剖開胸腹腔，然后用熒光成像儀采集圖像，觀察腫瘤在裸鼠全身、各臟器和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況。    1.3.3  腫瘤血管生成的成像  將對(duì)數(shù)生長期的LLC-GFP細(xì)胞，制成濃度為2×106/ml的單細(xì)胞懸液，按照0.2 ml/只皮下接種于血管較少的足背部。待接種后34周，腫瘤生長至1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm時(shí)，熒光成像儀觀察腫瘤血管生成情況。    1.3.

18、4  活體成像對(duì)CTX抑瘤率的評(píng)價(jià)  將裸鼠隨機(jī)分為三組，即空白對(duì)照組、模型組和環(huán)磷酰胺（CTX）組。接種LLC-GFP細(xì)胞兩周后，每日腫瘤局部注射給藥治療，其中CTX為10   mg/kg，模型組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水，空白對(duì)照組不予任何處置。給藥2周內(nèi)，每隔3天將各組動(dòng)物麻醉，用熒光成像儀進(jìn)行活體成像1次，觀察和記錄腫瘤生長情況，并評(píng)價(jià)CTX的抑瘤效果。    2  結(jié)果    2.1  培養(yǎng)細(xì)胞的熒光表達(dá)  對(duì)數(shù)生長期的LLC-GFP細(xì)胞置于熒光倒置顯微鏡下觀

19、察可見約有90%以上的細(xì)胞在470 nm藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光（圖1）。    2.2  移植瘤模型的建立  細(xì)胞接種后2周，裸鼠背部均長出平均大小約為1.2 cm×1.2 cm×1.0 cm的瘤塊，可見動(dòng)物活動(dòng)度略有減少，食欲不振。用熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行活體成像，激發(fā)光波長（470±20）nm，曝光時(shí)間343 ms，增益11。可見接種了LLC-GFP細(xì)胞的裸鼠背部腫瘤發(fā)出明亮的綠色熒光（圖2a），且熒光強(qiáng)度不隨照射時(shí)間的延長而減弱；而接種了LLC細(xì)胞的裸鼠活體成像未見有綠色熒光（圖2b）。  &#

20、160; 2.3  腫瘤生長動(dòng)態(tài)成像  在腫瘤細(xì)胞接種后第7天、18天、29天和40天，分別應(yīng)用熒光成像儀對(duì)裸鼠進(jìn)行活體成像。可見接種后1周開始小鼠背部均可見綠色熒光團(tuán)塊，隨著生長時(shí)間的延長，發(fā)出綠色熒光的區(qū)域（即腫瘤部位）逐漸增大，經(jīng)測(cè)量瘤從0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm逐漸增至2.0 cm×2.1 cm×1.5 cm，且熒光強(qiáng)度無衰減（圖3）。至25天時(shí)腫瘤表面出現(xiàn)肉眼可見的干酪樣壞死（圖3c），壞死處不發(fā)出熒光，但周圍瘤組織仍可見明亮的綠色熒光。    2.4  腫瘤轉(zhuǎn)移的成像&

21、#160; 在腫瘤細(xì)胞接種后40天，將模型鼠胸腹腔剖開，分別應(yīng)用熒光成像儀進(jìn)行成像，可見肺、胃、肝、膀胱、大網(wǎng)膜及腸系膜淋巴結(jié)和左上肢肌肉均有綠色熒光表達(dá)（圖4）。    2.5  腫瘤血管生成的成像  在腫瘤細(xì)胞接種后40天起，應(yīng)用熒光成像儀對(duì)足背部的腫瘤進(jìn)行成像，可見綠色熒光背景上清晰的血管網(wǎng)分布（圖5a），小血管和毛細(xì)血管管腔擴(kuò)張、彎曲（圖5b），血管密度隨時(shí)間增長及腫瘤增大而增加。    2.6  抑瘤率的評(píng)價(jià)  給藥40天后，可見CTX組腫瘤生長緩慢，瘤體積顯著小于模型組（圖6），其腫

22、瘤生長曲線與正常對(duì)照組的趨勢(shì)相一致（圖7）。    圖7  腫瘤細(xì)胞生長曲線    3  討論    1999年9月，Weissleder正式提出分子影像學(xué)的概念1，2。國際上，以哈佛大學(xué)為首的一些著名大學(xué)和研究機(jī)構(gòu)都相繼成立了分子影像研究中心，日本及歐洲很多國家也都積極投入了這一生命科學(xué)新領(lǐng)域的研究。    綠色熒光蛋白（green fluorecsent protein,GFP）基因是目前在光學(xué)分子成像中應(yīng)用較多的一種報(bào)告基因3，4。其最明顯優(yōu)勢(shì)是無需

23、底物或輔因子參與，無論在活細(xì)胞還是在完整的轉(zhuǎn)基因胚胎和動(dòng)物中，都能有效地監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)移的效率。在激發(fā)光下，可自發(fā)地發(fā)射內(nèi)部熒光，易于觀察，因此適合作為報(bào)告基因來研究基因的表達(dá)、調(diào)控、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等。近年來，GFP開始應(yīng)用在腫瘤的分子成像研究方面，由于GFP能在活細(xì)胞中直觀地觀察到外源基因的表達(dá)，較快篩選基因修飾的細(xì)胞，又不需外源物質(zhì)參與和對(duì)細(xì)胞無毒性5，因此本研究把GFP作為標(biāo)記基因。    本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用穩(wěn)定整合GFP基因的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞（LLC-GFP），建立了GFP高表達(dá)的裸鼠LLC移植瘤模型。體外培養(yǎng)LLC-GFP肺癌細(xì)胞，當(dāng)大部

24、分細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，細(xì)胞中GFP開始大量表達(dá)，熒光倒置顯微鏡下可見90%以上的細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光。一般來說，建立腫瘤動(dòng)物模型時(shí)，直到肉眼可見的或可觸及包塊穩(wěn)定存在兩周左右，才說明模型成功建立。但本實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長期LLC-GFP細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下，1周后用藍(lán)光激發(fā)后即可見接種部位發(fā)出綠色熒光。而且，隨著時(shí)間的延長，腫瘤逐漸長大，幾乎全部腫瘤都發(fā)出綠色熒光，且熒光強(qiáng)度不衰減。這說明所建立的模型穩(wěn)定，完全適合用于熒光活體成像，其所見熒光部分基本可代表腫瘤區(qū)域。    傳統(tǒng)的影像技術(shù)由于儀器的分辨率較低等問題，而對(duì)腫瘤的早期階段很難進(jìn)行明確的診斷6。本實(shí)驗(yàn)中，在腫

25、瘤細(xì)胞接種后1周，應(yīng)用熒光活體成像儀即可檢測(cè)到腫瘤的存在，為臨床腫瘤的早期診斷提供了一種極具前景的診斷方法。此外，還應(yīng)用熒光活體成像儀對(duì)腫瘤的動(dòng)態(tài)生長情況進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，無需其他成像手段或儀器的輔助，在活體上實(shí)時(shí)、連續(xù)、無創(chuàng)地觀察腫瘤的生長，這種分子影像學(xué)技術(shù)的應(yīng)用在國內(nèi)尚屬首例，為臨床上腫瘤進(jìn)展的監(jiān)測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便、實(shí)用的新方法。    對(duì)于腫瘤的各器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢出，以往只有在術(shù)中取材，進(jìn)行病理學(xué)檢查才能夠確定7。而分子影像學(xué)提出應(yīng)用報(bào)告基因的標(biāo)記或報(bào)告探針即可解決這一難題，即通過報(bào)告基因或探針的成像，間接地反映出腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況。本實(shí)驗(yàn)是以GFP為報(bào)告基因

26、，但由于GFP蛋白所發(fā)出的綠色熒光穿透力差，無法透過較厚組織8，必須解剖暴露后成像才能觀察到腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。因此尚需要進(jìn)一步的研究，提高儀器的分辨率或應(yīng)用發(fā)光強(qiáng)度更高的成像基因或熒光標(biāo)記物質(zhì)，才有望解決這一問題。    當(dāng)前，關(guān)于腫瘤血管生成機(jī)制及抗血管生成治療腫瘤研究已成為研究腫瘤的熱點(diǎn)9。腫瘤新生血管的形成是血管內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)及微環(huán)境相互作用的結(jié)果10，11。如何獲得腫瘤微血管生長情況一直是一項(xiàng)棘手的工作，傳統(tǒng)的微血管密度計(jì)數(shù)法必須將動(dòng)物處死、腫瘤組織切片作免疫組化12，而且應(yīng)用于標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體如CD31、CD34、F等特異性不強(qiáng)，因而無法

27、直觀、活體、動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察腫瘤微血管生成情況。這就阻礙了我們對(duì)血管生成對(duì)腫瘤生長轉(zhuǎn)移作用的理解，也影響我們研究抑制腫瘤血管生成藥物的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠足背接種腫瘤細(xì)胞來觀察血管生成情況，是因?yàn)樵撎幗M織相對(duì)透明，幾乎無原宿主血管，表達(dá)GFP的腫瘤和其供血血管之間強(qiáng)烈的視覺反差，使此處的移植瘤內(nèi)血管在熒光活體成像儀下清晰可見13；而且，可以在這些血管內(nèi)研究腫瘤細(xì)胞的傳輸和增殖，還可以看到腫瘤細(xì)胞在血管內(nèi)寄留，后者是腫瘤在休眠期的表現(xiàn)14。    此外，應(yīng)用熒光活體成像還可以對(duì)抗腫瘤藥物的療效進(jìn)行直觀的評(píng)價(jià)，而不需將動(dòng)物處死進(jìn)行腫瘤大小的測(cè)量。在環(huán)磷酰胺（CTX）治

28、療2周后通過活體熒光成像法和傳統(tǒng)的抑瘤率測(cè)定法，同時(shí)對(duì)CTX的療效進(jìn)行評(píng)價(jià)，其結(jié)果基本一致。相比之下，活體熒光成像法無需將動(dòng)物處死，可實(shí)時(shí)、連續(xù)地監(jiān)測(cè)療效，對(duì)于藥效學(xué)研究以及臨床藥物療效的判定具有極大的意義。    可以預(yù)見，分子影像研究今天的成果在未來510年內(nèi)，對(duì)生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域?qū)a(chǎn)生直接影響。分子影像學(xué)的開展使人們?cè)诜肿铀綄?duì)疾病機(jī)制及其特征有了更好的理解，并可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期篩查、轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)、抗血管生成及抗癌藥物療效的評(píng)估等方面的研究。如能夠更好地應(yīng)用腫瘤的特異性參數(shù)，如惡變前分子變異、生長動(dòng)力學(xué)、血管生長因子、癌細(xì)胞標(biāo)志物或遺傳學(xué)改變，將會(huì)大大地提高其診

29、斷準(zhǔn)確性和可靠性，并且提供比目前組織學(xué)檢查等更快的三維信息；如將分子影像和基因治療相結(jié)合，可在分子水平對(duì)治療效果進(jìn)行監(jiān)控、評(píng)判，從本質(zhì)上理解疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，在接近分子水平更早和更直接地觀察治療效果，最終提高對(duì)疾病的早期診斷預(yù)防和治療。     【參考文獻(xiàn)】  1 Weissleder R,Mahmood U.Molecular imaging.Radiology，2001，219（2）:316-333.    2 Weissleder R.Molecular imaging:explori

30、ng the next frontier.Radiology，1999，212（3）:609-614.    3 Sugiura K.Studies in a tumor spectrum.The effect of mitomycinc on the growth of a variety of mouse，rat and hamster tumores.Cancer Res，1959，19（4）:438-495.    4 OReilly M,Holmgren L,Shing Y,et al.Angiostat

31、in :a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell，1994，79（4）:315-328.    5 Fichtner I,Tanneberger S.Preoperative （neoadjuvant） chemotherapy in the murine Lewis lung carcinome and possible implications for clicnical use.A

32、nticancer Res，1987，7（2）:227-233.    6 Yang M,Baranov E,Wang JW,et al.Direct external imaging of nascent cancer,tumor progression,angiogenesis,and metastasis on internal organs in the fluorescent orthotopic model.Proc Natl Acad Sci USA,2002，99（6）:3824 - 3829.    7 Farina KL,Wyckoff JB,Rivera J,et al.Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.Cancer Res，1998,58（2）:2528-2532. &