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IP屬地：湖北 上傳時間：2022-02-26 格式：DOC 頁數(shù)：4 大小：18KB 積分：15 舉報 版權申訴

1、感?？沽鞲胁《镜膶嶒炑芯?作者：時間：2007-11-22 14:10:00 作者：申元英 楊占秋 王晶 潘云華 郭利軍 王濤 白麗 【關鍵詞】 細胞培養(yǎng)【摘要】 目的 探討感停抗病毒的療效。方法 采用微量細胞培養(yǎng)法進行抗病毒療效和病毒滴定。結果 感停對流感病毒的最小治療濃度為:3.25g/ml，感停對流感病毒的治療指數(shù)（therapy index，TI）為8。經(jīng)最小有效劑量感停作用后，流感病毒的滴度由10 4.3 TCID 50 /0.1ml下降為10 2.3 TCID 50 /0.1ml。結論 感停在體外對流感病毒有一定的治療作用。關鍵詞 感停 流感病毒 抗病毒實驗 細胞培養(yǎng) 【Abstr

2、act】 Objectives To evaluate the therapeutic effect of Ganting against influenza virus.Methods Micro-well cell cultures was adopted to observe anti-viral activity and titer the virus.Results The minimal concentration of Ganting was3.25g/ml，the titer of influenza virus declined from10 4.3 TCID 50 /0.1

3、ml to10 2.3 TCID 50 /0.1ml after treated by minimal concentration，and the therapy indexwas8.Conclusion Ganting has certain therapeutic effect in fighting influenza virus in vitro. Key words Ganting influenza virus anti-viral activity cell culture 滇虹藥業(yè)有限公司根據(jù)中藥的作用機制研制了一種抗病毒新藥感停外用噴鼻劑。本研究通過感停的抗流感病毒的實驗研究

4、，旨在找到一種有效的早期預防和治療急性上呼吸道病毒感染的藥物，并為該藥的開發(fā)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。 1 實驗材料 1.1 細胞株 狗腎細胞系（MDCK）由武漢大學典型細胞保藏中心提供。細胞生長液為10%新生犢牛血清199培養(yǎng)液，內(nèi)含100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素;細胞維持液除含新生犢牛血清含量為2%和2g/ml胰蛋白酶外，其它成分同細胞生長液。 1.2 病毒株 流感病毒為本室保存。病毒型分別為:A/SH/S/84（H 3 N 2 ）E 2 。病毒經(jīng)MDCK細胞活化增殖，細胞病變（CPE）達75%以上（+）時收獲，滴定其滴度為10 5 TICD 50 /0.1ml。1.3 藥物 1.4

5、 主要試劑 199培養(yǎng)基，DIBCOBRL公司生產(chǎn)，批號:1090813。胰蛋白酶，Difico分裝，上海金路貿(mào)易公司銷售。新生犢牛血清，中國云南鄧川蝶泉生物血清廠出品，產(chǎn)品批號:20030607002。青霉素，哈藥集團制藥總廠生產(chǎn)，產(chǎn)品批號:A03062318。鏈霉素，華北制藥公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號:021111。2 方法 2.1 藥物毒性測定分別按下列劑量將感停藥液（10X）加入到生長為良好單層的24孔DMCK細胞培養(yǎng)孔:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90l/ml，每一藥物劑量設3個重復孔，于37，5%CO 2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

6、4天，每天觀察藥物對細胞的毒性。 2.2 感停的體外抗病毒實驗 根據(jù)病毒的增殖周期，擬定感停對流感病毒的作用方式共分3組:（1）藥物殺病毒作用組:分別將藥物（2 -2 稀釋）直接和100TCID 50 /0.1ml病毒作用后，再把它們的混合液加到細胞表面，37、5%CO 2 孵育2h后，棄上清液，加入細胞維持液培養(yǎng)，觀察藥物對病毒的直接殺傷作用，連續(xù)觀察3天。同時設病毒唑（陽性對照）、NS（陰性對照）和細胞對照。每一劑量分別設3個復孔。（2）藥物抗病毒吸附組:采用最大細胞毒劑量的感停進行2 -2 稀釋，然后加到細胞表面，37、5%CO 2 中孵育2h，棄上清液，分別用100TCID 50 /0

7、.1ml流行性感冒病毒攻擊細胞，37、5%CO 2 中孵育2h，棄上清液，加細胞維持液37、5%CO 2 培養(yǎng)，連續(xù)觀察3天。同時設病毒唑（陽性對照）、NS（陰性對照）和細胞對照。每一劑量分別設3個復孔。（3）治療組（抗病毒復制、合成組）先分別用100TCID 50/0.1ml流行性感冒病毒吸附細胞，37、5%CO 2 中孵育2h，棄上清液，再分別用細胞維持液經(jīng)2 -2 稀釋的最大細胞毒劑量的藥物與細胞一起培養(yǎng)，使藥物作用于細胞內(nèi)的流行性感冒病毒以觀察藥物對病毒的抑制作用，連續(xù)觀察3天。同時設病毒唑（陽性對照）、NS（陰性對照）和細胞對照。每一劑量分別設3個復孔。最后，滴定最小有效劑量孔的病毒

8、滴度。 2.3 病毒滴定 將各實驗組藥物作用的細胞培養(yǎng)板反復凍融3次后，合并同一劑量重復孔懸體，分別取0.1ml按10 -1 稀釋，滴定細胞凍融液中病毒滴度，并重復3孔。3 結果 3.1 藥物對細胞的毒性作用 感停對狗腎細胞（DMCK）的最大細胞毒性為20l/ml（26g/ml）。 3.2 藥物作用方式 （1）感停對流感病毒的最小治療濃度為:3.25g/ml;（2）直接殺流感病毒的最小濃度為:13g/ml;（3）感停不能預防流感病毒的感染。 感停對流感病毒的治療指數(shù) 1 （therapy index，TI）等于8。治療組細胞凍融液中病毒滴度經(jīng)最小有效劑量感停作用后，細胞凍融液中流感病毒的滴度為

9、10 2.3 TCID 50 /0.1ml，病毒唑組的病毒滴度為10 2.7 TCID 50 /0.1ml，NS對照組的病毒滴度為10 4.3 TCID 50 /0.1ml。 4 討論由于病毒屬于非細胞型微生物，具有個體微小，結構簡單，必須在活細胞內(nèi)增殖等特點。病毒感染后，一方面，由于臨床癥狀出現(xiàn)時，組織細胞已經(jīng)出現(xiàn)了嚴重損傷，另一方面，由于病毒的超級寄生性，迄今，我們較難找到一種對細胞毒性較低而抗病毒活性較高的藥物，因此，病毒的預防和治療一直是各國科學家研究的重要領域。盡早預防和治療病毒感染對縮短病毒感染疾病的病程和減輕臨床癥狀具有十分重要的社會和經(jīng)濟意義。 研究表明，感停具有直接殺傷流感病

10、毒作用，可避免病毒進入細胞，防止流行性感冒和普通感冒，同時，感停也能抑制胞內(nèi)病毒的復制，對流行性感冒和普通感冒均有一定的治療作用，其對流感病毒的治療指數(shù)為8，經(jīng)最小有效劑量感停作用后，流感病毒的滴度由10 4.3 TCID 50 /0.1ml下降為10 2.3 TCID 50 /0.1ml。 感停對流感病毒無預防作用，說明感停沒有和細胞表面的受體結合，可能是由于感停屬于中藥復方，成分復雜， 針對細胞表面的單一病毒受體的成分含量低，或以復合物形式存在，不能與細胞表面受體結合，從而不能預防病毒的感染。但能直接殺傷病毒和抑制胞內(nèi)病毒的復制，也證明感停對呼吸道常見病毒具有一定的預防和治療作用，感停對病毒的直接殺傷作用推測可能是感停中的有效成分對病毒包膜的作用，感停對已經(jīng)進入胞內(nèi)的流感病毒也有一定的抑制作用，其作用機制可能是抑制病毒核酸復制或阻止病毒蛋白合成，這有待于進一步研究。 體外（in vitro）藥理研究具有快捷迅速、敏感特異、條件易控等優(yōu)點，在藥物的活性篩選、毒性評價與深入細胞分子藥理等研究中起重要作用 25 。隨著細胞生物學與生物化學技術的不斷發(fā)展，體外藥理研究方法日新月異，使得人們能夠更加