重組人Leptin的表達(dá)、純化及免疫學(xué)與生物學(xué)活性鑒定

1、重組人Leptin的表達(dá)、純化及免疫學(xué)與生物學(xué)活性鑒定張 砡，王曉輝，馮澤國(guó)（解放軍總醫(yī)院麻醉手術(shù)中心 北京 100853）【摘要】目的：為了獲得重組人Leptin（rh-leptin）蛋白高表達(dá)的菌株及大量具有生物活性的rh-leptin蛋白，構(gòu)建Leptin重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，對(duì)rh-leptin蛋白進(jìn)行復(fù)性及純化，并鑒定其免疫學(xué)及生物學(xué)活性。方法：提取脂肪組織RNA，通過(guò)RT-PCR方法獲得用PCR方法擴(kuò)增人Leptin的編碼區(qū)，使產(chǎn)物與pGEM-T easy載體相連，轉(zhuǎn)染DH5。測(cè)序后,選出陽(yáng)性克隆質(zhì)粒擴(kuò)增。將酶切后的leptin片段與pET-28a(+)載體連接，獲

2、得leptin的表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，測(cè)序結(jié)果顯示Leptin編碼區(qū)沒(méi)有突變產(chǎn)生，用IPTG誘導(dǎo)leptin重組蛋白表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western印跡雜交進(jìn)行免疫學(xué)分析。并通過(guò)Km小鼠減肥實(shí)驗(yàn)及胃腸推進(jìn)率測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其生物學(xué)活性。結(jié)果：在包涵體蛋白22 kDa處有明顯的新增蛋白帶,其含量超過(guò)總蛋白的50；經(jīng)Western-blot證實(shí)為重組的人leptin蛋白。大量表達(dá)后，經(jīng)蛋白復(fù)性和純化，通過(guò)Km小鼠減肥實(shí)驗(yàn)及胃腸推進(jìn)率測(cè)定實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組表達(dá)的人Leptin蛋白具有生物學(xué)活性。結(jié)論：成功構(gòu)建了rhleptin的高表達(dá)菌株，建立了rhleptin

3、的純化與復(fù)性方法，經(jīng)驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物具有免疫學(xué)及生物學(xué)活性，可供進(jìn)一步基礎(chǔ)及臨床研究應(yīng)用。 【關(guān)鍵詞】rhleptin；克隆; 表達(dá); 融合蛋白; 大腸桿菌；復(fù)性；蛋白純化；生物活性Expression, Purification and Identification for Immunological and Biological Activity of Recombined Human LeptinAbstractObjective: To obtain effective method of high recombined human leptin (rh-leptin) expressio

4、n in E. coli and the method of purifying and renaturing the rh-leption protein, then to obtain a large amount of rh-leptin protein with immunological and biological activity for further research. Methods: The adipose Leptin CDs was obtained by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

5、 and cloned by PCR, and the product was connected with pGEM-T easy and transformed into DH5. After DNA sequencing, the positive colonies were picked out and amplified. The cleaved leptin fragment was cloned into pET-28a(+).Then, the recombined plasmid of leptin was transformed into BL21(DE3). DNA se

6、quencing result showed that no mutation was found in rh-leptins CDS. After IPTG induction, the cell lysate was directly used for SDS-PAGE. After purification and renaturation, the immunological activity of rh-leptin was checked by Western-blot. Its biological activity was checked by reducing the wei

7、ght and food intake and inhibiting the gastrointestinal motility of Km mice. Results: There was a new band of protein ( 50 % total protein) around 22 KDa on SDS-PAGE. The band was proved by Western-blot to be rh-leptin, which was highly expressed in the BL21(DE3)/ pET-28a(+) system , and the rh-lept

8、in has immunological activity. Its biological activity was confirmed by reducing the weight and food intake and inhibiting the gastrointestinal motility of Km mice. Conclusion: Highly expressed rh-leptin can be obtained in our lab. Purified rh-leptin with immunological and biological activity may be

9、 used in further research.Key words：Cloning; Expression; Fusion Protein; E. coli; Rh-leptin; Renaturation; Protein purification; Biological activityLeptin（瘦素或消脂素）是ob基因編碼的活性蛋白分子，主要由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)機(jī)體攝食和能量代謝中發(fā)揮著主要作用。近年來(lái)，臨床實(shí)驗(yàn)表明，血清leptin水平異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)1。為了進(jìn)一步探討Leptin的生物學(xué)作用，大量獲得Leptin蛋白以便進(jìn)一步研究其功能及調(diào)節(jié)機(jī)制，探討rh-

10、leptin(重組人Leptin)用于臨床治療的可行性和生理作用，我們對(duì)人Leptin進(jìn)行了克隆重組及表達(dá)，對(duì)rh-leptin進(jìn)行復(fù)性和純化后，鑒定其免疫學(xué)和生物學(xué)活性。材料與方法1 材料1.1 質(zhì)粒和菌株 pGEM-T easy克隆載體為Promega公司產(chǎn)品；pET-28a表達(dá)載體為Novagen公司產(chǎn)品；DH5和BL21（DE3）宿主菌株為T(mén)IANGEN公司產(chǎn)品。1.2 組織來(lái)源 取自手術(shù)患者腹部皮下脂肪。1.3 酶和試劑 各種酶類，如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、限制性內(nèi)切酶EcoR、Xhol和T4連接酶，以及質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、異丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）等為

11、Promega公司產(chǎn)品；Trizol為Invitorgen公司產(chǎn)品；兔抗人Leptin多克隆抗體(PcAb)為本室免疫獲得，抗His.Tag單克隆抗體(McAb)及羊抗兔IgG(二抗)為普利萊公司產(chǎn)品。1.4 引物合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)，針對(duì)Leptin的編碼區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在上、下游引物的5端分別加入酶切位點(diǎn)EcoR和Xho。上游引物（U）序列：5 CG GAA TTC ATG CAT TGG GGA ACC CTG TG 3；下游引物（D）序列：5 CCG CTCGAG TCA GCA CCC AGG GCT GAG GT 3（北京奧科公司合成）。1.5 緩沖液配置 緩沖液A為T(mén)ri

12、s-HCl 50mmol/L，PH7.9，含EDTA 0.5mmol/L，NaCl 50mmol/L，DTT 0.25mmol/L，甘油5%；緩沖液B為T(mén)ris-HCl 50mmol/L，PH7.9，含EDTA 0.5mmol/L，NaCl 50mmol/L，DTT 0.25mmol/L，甘油15%。1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20g左右的雄性Km小鼠32只，由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2 方法2.1 RT-PCR擴(kuò)增 將脂肪組織(350 mg)置于冰浴后的Trizol(1.2ml)中勻漿，提取總RNA，測(cè)量處吸光度值(A260),定量后立即逆轉(zhuǎn)錄再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94，30s；66，5

13、0s；70，60s。共32個(gè)循環(huán)。2.2 Leptin克隆載體的構(gòu)建 將上述帶有酶切位點(diǎn)的leptin PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA凝膠純化回收后，在T4連接酶作用下，與pGEM-T easy載體相連，構(gòu)建leptin的克隆載體，轉(zhuǎn)染DH5感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定（北京華大公司）。2.3 Leptin原核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 利用EcoR和Xho分別酶切構(gòu)建好的leptin克隆載體以及pET-28a(+)表達(dá)載體，將獲得的二者產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化回收后,進(jìn)行連接，構(gòu)建leptin表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染DH5，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E .coli BL21(DE3)菌株。2.4誘導(dǎo)H

14、is.Tag-Leptin融合蛋白表達(dá) 挑轉(zhuǎn)化后單菌落，在LB培養(yǎng)液中37 振蕩過(guò)夜。培養(yǎng)物1：100稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（A550=0.8），加入IPTG（1 mmol/L）于22 誘導(dǎo)4 h。超聲破碎細(xì)菌后，分別取上清及包涵體進(jìn)行表達(dá)分析。2.5 表達(dá)蛋白的分析鑒定 將上清及包涵體樣品分別于12 %聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行垂直電泳（SDS-PAGE），鑒定leptin融合蛋白表達(dá)的位置。2.6包涵體的制備 取200mL 含有rh-leptin表達(dá)質(zhì)粒的E.coli菌液，經(jīng)組織破碎器短暫勻漿后重懸于20mL緩沖液A中，在冰浴中超聲裂菌，4、13000r/min離心10min，收集沉淀的包

15、涵體，用0.1%Triton-100洗滌2次。以19.6mL緩沖液A和0.4 mL 20%SKL懸浮包涵體，室溫靜置30min，4、13000r/min離心10min，收集上清。2.7 rh-Leptin復(fù)性與濃縮 對(duì)溶解物進(jìn)行蛋白定量。用緩沖液B稀釋溶解蛋白至0.1mg/mL，SKL終濃度為0.04%。4溶解蛋白，以1000mL緩沖液A攪拌透析24h，間隔換液3次。取出后濃縮至20-30mL。2.8 rh-leptin的免疫活性鑒定 將蛋白樣品于12 %SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。封閉后,與leptin PcAb結(jié)合，進(jìn)行Western印跡雜交檢測(cè)，利用ECL系統(tǒng)進(jìn)行顯色。2

16、.9 rh-leptin的生物活性鑒定 Km小鼠正常飼養(yǎng)3天，去除體重17g和21g的小鼠，隨機(jī)分為兩組（n10）。禁食48h，降低內(nèi)源性leptin水平后，按rh-leptin 2.5mg/kg或緩沖液7.75mL/kg，腹腔注射2/日，每日定時(shí)稱重并觀察食物攝入量。12只Km小鼠隨機(jī)分為rh-leptin組（n=6）和對(duì)照組（n=6）。禁食12h，腹腔注射rh-leptin 2.5mg/kg或生理鹽水12.5mL/kg，3h后每只小鼠均給予5%炭末阿拉伯膠混懸液0.2mL/10g。灌胃后15min，小鼠頸椎脫臼法處死，剖開(kāi)小鼠腹腔，取出胃腸道(去除腸系膜)，將腸管下端墜以5g砝碼。以幽門(mén)為

17、起點(diǎn)，測(cè)量炭末在腸管內(nèi)的移動(dòng)距離和小腸（自幽門(mén)至回盲部）的全長(zhǎng)，計(jì)算每只小鼠炭末移動(dòng)距離占小腸全長(zhǎng)的百分率，比較兩組小鼠結(jié)果的差異。2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行成組t檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、PCR擴(kuò)增人leptin編碼區(qū)序列：PCR擴(kuò)增人leptin編碼區(qū)序列產(chǎn)物如圖1所示，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于520 bp處出現(xiàn)清晰的條帶，與預(yù)計(jì)的leptin大?。?21 bp）相符。圖1 Leptin編碼區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳注：1.為DL 2000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA marker);2.為帶酶切位點(diǎn)的leptin編

18、碼區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 2、pET-28a(+)-leptin重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定：將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中人leptin的CDS序列完全一致，表明目的基因完全符合設(shè)計(jì)要求。3、pET-28a(+)-lepin重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的分析：如圖2所示，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，重組表達(dá)產(chǎn)物在22 kDa處有一明顯的條帶（與leptin相符），且主要存在于包涵體中(占總蛋白的50以上)，而對(duì)照組則無(wú)相應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)。圖2 pET-28a(+)-lepin重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析注：14為對(duì)照組，分別為： pET-28a(+)空質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)4 h 后:1.包涵

19、體；2.上清； pET-28a(+)空質(zhì)粒無(wú)誘導(dǎo)4 h后: 3.包涵體；4.上清。5、6為重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物： pET-28a(+)-lepin重組質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)4 h后: 5.包涵體；6.上清。4、rh-leptin的免疫學(xué)活性鑒定：分別利用leptin PcAb及His.Tag McAb的抗體進(jìn)行Western印跡雜交，證實(shí)了此條帶的特異性（圖3 A、圖3 B）。且融合蛋白His.Tag-leptin在菌體上清及包涵體中均有表達(dá)，但主要在包涵體中存在。圖3 Western印跡雜交分析重組表達(dá)蛋白的特異性注：圖3 A為用leptin PcAb進(jìn)行Western blot分析的結(jié)果；圖3 B為

20、用His.Tag McAb進(jìn)行Western blot分析結(jié)果。 圖中14均為對(duì)照組，即pET-28a(+)空質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)4 h后：1.包涵體；2.上清； pET-28a(+)空質(zhì)粒無(wú)誘導(dǎo)4 h后: 3.包涵體；4.上清。5、6為重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物： pET-28a(+)-lepin重組質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)4 h后: 5.包涵體；6.上清。5、rh-leptin的生物活性鑒定：由圖4可見(jiàn)，小鼠腹腔注射rh-leptin 2天后體重增長(zhǎng)即明顯低于緩沖液組，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)rh-leptin組小鼠的體重改變比（體重改變量/原始體重100）均小于緩沖液組。圖4 rh-leptin對(duì)小鼠體重改變比(%)的

21、影響（n=10）注：與緩沖液組相比，*P0.05 rhleptin組； 緩沖液組腹腔注射rh-leptin對(duì)進(jìn)食的抑制情況見(jiàn)圖5，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)rh-leptin組小鼠的進(jìn)食量改變比明顯低于緩沖液組，顯著抑制小鼠進(jìn)食。由此可見(jiàn)重組表達(dá)的leptin具有良好的生物學(xué)活性。圖5 rh-leptin對(duì)小鼠進(jìn)食量改變比(%)的影響（n=10）注：與緩沖液組相比，*P0.05 rhleptin組； 緩沖液組rh-leptin組小鼠胃腸推進(jìn)率明顯低于生理鹽水組（P0.05），說(shuō)明腹腔注射rh-leptin在一定時(shí)間范圍內(nèi)可以抑制小鼠胃腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)。同樣證明了rh-leptin具有生物學(xué)活性。表 rhlepti

22、n組與生理鹽水組胃腸炭末推進(jìn)率比較組別動(dòng)物數(shù)（只）胃腸推進(jìn)率(%)rh-leptin組生理鹽水組6641.985.81 *54.5311.08注：與生理鹽水組相比，*P 0.05。討 論自從1994年Zhang等首次從脂肪細(xì)胞里克隆出ob基因以來(lái)，leptin迅速成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)2。研究表明：leptin作為一種脂肪組織與下丘腦之間的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白對(duì)維持體內(nèi)正常的脂肪水平起著重要的作用。因此，最初的針對(duì)leptin的研究主要局限在減肥領(lǐng)域。但是，在進(jìn)行II期臨床研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，leptin在人體中減肥效果非常微弱，遠(yuǎn)低于在動(dòng)物試驗(yàn)中取得的效果。 越來(lái)越多的研究證實(shí)，作為一種脂肪細(xì)胞因子，Lepti

23、n參與了糖尿病、神經(jīng)內(nèi)分泌性高血壓、肝炎和肝纖維化、創(chuàng)傷感染等引起的膿毒血癥、部分重要臟器的缺血再灌注損傷過(guò)程等病理生理的調(diào)節(jié)機(jī)制3，4, 具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。目前已觀察到多種藥物（格列酮類、他汀類、貝特類、血清轉(zhuǎn)胺酶抑制劑、大麻素-1 受體拮抗劑）可以影響血清中l(wèi)eptin水平5。表明leptin 在病理狀態(tài)時(shí)具有潛在的作用。我們近期的研究發(fā)現(xiàn)：肝臟I/R損傷、嚴(yán)重肺感染致多器官衰竭綜合征患者及急性心?；颊叩难錶eptin水平與正常人相比顯著升高，提示它可能是急性炎癥發(fā)生后的重要應(yīng)答因子6，7。研究者們認(rèn)為leptin是一個(gè)頗具前景的具有多元化作用的治療靶點(diǎn)。因此，重組表達(dá)和純化有生物活

24、性的rh-leptin對(duì)于繼續(xù)研究leptin在創(chuàng)傷修復(fù)及應(yīng)激反應(yīng)中的保護(hù)作用具有重要意義。Novagen公司的pET表達(dá)體系是目前在原核細(xì)胞中克隆和表達(dá)融合蛋白的最佳體系之一。本實(shí)驗(yàn)選用BL21(DE3)/pET-28a()作為表達(dá)體系有下述優(yōu)點(diǎn)： pET-28a()使用T7Lac啟動(dòng)子，其上游的LacI編碼足夠的Lac抑制子，阻斷T7RNA聚合酶的產(chǎn)生和其對(duì)外源基因的轉(zhuǎn)錄，使基礎(chǔ)表達(dá)水平降到最低，可提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 pET-28a()的多克隆位點(diǎn)區(qū)域(BamH-Xho)下游含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，可以有效地阻止通讀；轉(zhuǎn)錄的mRNA3-尾形成二級(jí)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可阻止降解，延長(zhǎng)壽命8。 BL2

25、1（DE3）菌株缺乏OmpT外膜蛋白酶，有利于防止表達(dá)產(chǎn)物在提純時(shí)降解;攜帶T7 RNA聚合酶基因的噬菌體DE3已整合于細(xì)菌基因組，可通過(guò)IPTG誘導(dǎo)使之表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)T7 Lac啟動(dòng)子，開(kāi)始目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。此外，pET-28a()在N端含有His.Tag寡聚組氨酸鏈的同時(shí),C端也具有可選的His.Tag，因此,表達(dá)出的融合蛋白在多種情況下都可以便利地和經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行純化。我們?cè)谶\(yùn)用BL21(DE3)/pET-28a()體系高效地表達(dá)了rh-leptin的基礎(chǔ)上，獲得了主要以包涵體形式存在（50）的rh-leptin融合蛋白。將包涵體以0.1%Triton-100洗滌后用SKL溶解，進(jìn)一步濃縮

26、后，得到了高純度有免疫學(xué)活性的目的蛋白。在對(duì)rh-leptin生物學(xué)活性鑒定時(shí)，選用了兩種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＝?jīng)典的小鼠減肥及進(jìn)食量抑制實(shí)驗(yàn)9，Leptin作為一種脂肪組織與下丘腦之間的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白對(duì)維持體內(nèi)正常的脂肪水平及調(diào)節(jié)進(jìn)食起著重要的作用10。給予外源性rh-leptin后顯著抑制了小鼠的體重及進(jìn)食量增長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選用20g的Km小鼠，正處于生長(zhǎng)發(fā)育期。但通過(guò)與對(duì)照組比較，rh-leptin對(duì)小鼠進(jìn)食和體重增長(zhǎng)的抑制作用仍清晰可見(jiàn)；小鼠胃腸推進(jìn)率測(cè)定模型實(shí)驗(yàn)， leptin可通過(guò)迷走膽堿能神經(jīng)和膽囊收縮素A（CCK-A）介導(dǎo)的作用持續(xù)性抑制胃運(yùn)動(dòng)，影響食物排空，導(dǎo)致胃腸推進(jìn)率降低11，12。本

27、文觀察到給予rh-leptin組小鼠的胃腸推進(jìn)速率降低，與對(duì)照組相比有顯著性差異。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)重組表達(dá)了rh-leptin，建立了其分離純化技術(shù)，獲得了高純度的具有免疫學(xué)和生物學(xué)活性的rh-leptin蛋白，為進(jìn)一步開(kāi)展leptin的臨床和基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn): 1 Kelesidis T, Mantzoros C S. The emerging role of leptin in humansJ. Pediatr Endocrinol Rev, 2006, 3(3):239-248.2 Zhang Y, Proenca R, Maffei M, et al. Positiona

28、l cloning of the mouse obese gene and its human homologueJ. Nature,1994,372 (6505):425-432. 3石燕，顏光濤，林季. 探討急性應(yīng)激因子誘導(dǎo)Leptin水平降低J. 標(biāo)記免疫分析與臨床，2004,11(4):215-219.4 李宏睿，孫文夏. 瘦素功能研究進(jìn)展J. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2004,12:108-112.5 Paraskevas K I , Liapis C D, Mikhailidis D P. Leptin: a promising therapeutic target with pleiotropic action b