最新常用的半抗原與蛋白偶聯(lián)方法簡(jiǎn)介

1、常用的半抗原與蛋白偶聯(lián)方法簡(jiǎn)介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶聯(lián)）1、混合酸酐法，也稱氯甲酸異丁酯法（isobutylchloroformate method ）偶聯(lián)時(shí)，半抗原分子中的羧基可與氯甲酸異丁酯在 有機(jī)溶劑中形成混合酸酐 （mixed acid an hydride）, 然后與蛋白分子中的氨基形成肽鍵。氨甲喋吟（MIT）與p-半乳糖苷酶偶聯(lián)的混合 酐法1、5. 8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷卻至 10度，加2ul氯甲酸異丁酯，10度攪拌反應(yīng)30分 鐘。2、1.5mg 酶用 2ml 50 m mol/L Na2CO3 溶解。3、10度反應(yīng)4小時(shí)（必要時(shí)加NaOH

2、以維持溶液的 pH為9.0 , q然后4度過(guò)夜。4、 過(guò) sephadex G-25 層析柱，柱用含NaCI 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巰基乙醇 10 m mol/L 的50m mol/L Tris- 醋酸緩沖液（pH7.5）平衡和洗 脫，合并含酶的洗脫管內(nèi)液體，進(jìn)一步純化后，保 存于含 BSA 0.1 %（w/v ）、NaN3 0.02%（w/v）的緩沖 液中。碳化二亞胺法制備 3,3,5-三碘甲腺氨酸-血藍(lán) 蛋白免疫原的操作步驟1、取 EDC 100mg ,用 pH8.0 的 10 m mol/L PBS液 2.5ml使之充分溶解（I液2、取3 , 3,5

3、-三碘甲腺原氨酸25mg ,用0.2mol/L NaOH 溶液 2ml 溶解（II 液）3、取血藍(lán)蛋白（lemocyanin） 25mg,溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III 液）4、將II液與III液混合，在磁力攪拌下逐滴 加入I液（余下0.5ml :5、室溫下避光攪拌1小時(shí)，逐滴加入余下的I 液6、4度攪拌12小時(shí)7、靜置10小時(shí)（4度&有蒸餾水使之充分透析（約48小時(shí)），得免疫原。孕酮與與3 -半乳糖苷酶偶聯(lián)的 N-羥琥珀酰亞 胺酯法1、用二堊烷（dioxane）溶解孕酮-11-半琥珀酸 酯，配成濃度為100m mol/L的溶液。2、加羥琥珀酰亞胺（N-hydroxy

4、succi ni mide）100 m mol/L禾口 DCC （二環(huán)已基碳化二亞胺），200m mol/L, 4 度反應(yīng)16小時(shí)。3、用簿層掃描方法純化（氯仿：水=9: 1）4、按孕酮/酶摩爾濃度比約為10的比例，將上 述溶液加入到酶液（用 pH7.4,濃度50 m mol/L的 磷酸緩沖液溶解）中。5、（二）含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián) 芳香胺類半抗原與蛋白質(zhì)重氮化偶聯(lián)的操作步驟 1、 用 0.1 mol/L HCl 溶液配制 4 m mol/L 濃度的半抗原。2、滴加1% NaNO2過(guò)量）,4度持續(xù)攪拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物試紙或 在白色磁磚上加1 %淀粉和 50m m

5、ol/L KI進(jìn)行監(jiān)控。游離亞硝酸可將氧化物氧化成碘，碘再與淀粉 反應(yīng)變成藍(lán)黑色。3、溶液變成藍(lán)黑色后，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘。4、 用pH9.0、濃度為 200m mol/L的硼酸或碳酸緩沖液溶解蛋白。5、邊攪拌，邊加入重氮化的半抗原(防止局部發(fā)生酸過(guò)量 現(xiàn)象)，調(diào)節(jié)pH到9.5。6、冰箱中攪拌反應(yīng)2小時(shí)，不斷調(diào)節(jié)pH到9.0。 7、用PBS透析2天8-20度保存(濃度為20mg/mL 雙功能的酰亞胺酯(imidateesters)可以氨基反應(yīng)，形成脒。例如：用二甲基已二酰亞胺酯 (dimethyladipimide) 將去 甲基三 正喋吟 (desmethylmortriptyline) 與 3

6、 -半乳糖苷酶偶聯(lián)。應(yīng)用雙功能酰亞胺酯(imidate esters )制備 去甲基三正喋吟-與3-半乳糖苷酶標(biāo)記特的操作步 驟1、 用含5%( W/V N-乙基嗎啉的無(wú)水甲醇 0.4ml,在室溫下溶解570ug去甲基三正喋吟和488ug 二 甲基已 二酰亞 胺酉旨(dimethyladipimide)(A 液)2、 取與3 -半乳糖苷酶100 ug,溶于 pH9.9 的 100 m mol/L 碳酸緩沖液(含 MgCI2 10m mol/L,2- 巰 基乙醇 10 m mol/L 0.1ml(B 液) 3、將A液倒入B液。4、20度反應(yīng)90分鐘后，力口含 NaCI 100 m mol/L,

7、MgCl2 10 m mol/L 和 2-巰基乙醇 10 m mol/L、pH7.5 的 Tris- 醋酸緩沖液(50m mol/L) 1ml,終止反應(yīng)。5、過(guò)sephadex G-25,去除小分子物質(zhì)，得酶標(biāo)記物(約75%的酶與半抗原結(jié)合，但用三正喋吟 代替去甲三正喋吟 (demethylmortriptyli ne ) 進(jìn)行 偶聯(lián)，則只有15%的酶與之結(jié)合。(三)含巰基半抗原的偶聯(lián) 可用馬來(lái)酰亞胺方法與蛋白偶聯(lián)。此外，將載體蛋白用溴乙酰胺（bromoacetamide）激 活?；?qū)⑤d體蛋白與半抗原在pH4.0的醋酸緩沖液中，通過(guò)過(guò)氧化氫的作用形成二硫鍵，也可以將半 抗原連接到蛋白質(zhì)分子上。

8、（四）含羥基的半抗原偶聯(lián)醇類羥基通過(guò)形成半琥珀酸酯轉(zhuǎn)化為羧基的操 作步驟1、15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol ）,12g 琥珀酸酐（succinican hydride）禾口 8.7ml 三乙基胺（triethylamime） 用 100 ml乙酰乙酯溶解。2、加熱回流1小時(shí)。3、減壓蒸餾去溶劑，,殘余物用5% NaHCO水溶液溶解。4、用乙醚洗滌兩次，然后用 H2SO4進(jìn)行s酸化（pH到2.0）. 5、用水洗滌固形物（為三氯乙基半琥珀酸酯）兩次，用氯仿-已烷使其結(jié)晶（產(chǎn)量約 75%,熔點(diǎn) 88-89度）6、 取 2.5g半琥珀酸酯溶于6.5ml亞硫酰

9、氯（thionyl chloride）中，65度加熱30分鐘。7、減壓蒸發(fā)，干燥1小時(shí)（高度真空條件下）。& 將上述產(chǎn)生（2, 2, 2-三氯憶基琥珀酰氯）溶于 15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺（N,N- dimethylethylacetamide） 中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 小時(shí)。9、65度真空蒸發(fā)后，用異丙醇使結(jié)晶析出來(lái)（得鹽酸化的結(jié)晶-5-酯約84%,熔點(diǎn)160 度）。10、用溶于二甲基甲酰胺中的鋅和醋酸解離 三氯乙酉旨，得f半抗原-半琥珀酸酯，這樣引和的羧 基可與蛋白質(zhì)偶聯(lián)（如用碳化二亞胺化）。半抗原用NalO4氧化其中的糖苷醇后再與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的操 作步驟1、 20mg腺苷溶于1ml

10、100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反應(yīng)30分鐘。2、加1滴乙二醇（得A液）3、將A液加入到p -半乳糖苷酶液（20mg/ml,用 150m mol/L NaCI,10m mol/L MgCI2水溶液溶解，用3% K2CO3調(diào)節(jié)pH至9.0 ）中4、4度反應(yīng)2小時(shí)，期間不斷調(diào)節(jié)pH9.0 5、加入臨時(shí)配制的 50 mg/ml NaBO4溶液，用量為反應(yīng)體積的1/10。4度反應(yīng)過(guò)夜。6、用含有 MgCl2 10m mol/L,2-巰基乙醇10 mmol/L、NaCl 100 m mol/L 的 50 m mol/L 磷酸緩沖 液（pH7.4）透析（更換透析液數(shù)次）（五）含酮基或 酮基

11、半抗原的偶聯(lián)是將酮基經(jīng)羥胺類化合物處理變 成肟類化合物，再進(jìn)一步將肟類化合物中的羥基， 衍變成羧基化合物，再進(jìn)一步進(jìn)行含羧基半抗原的 偶聯(lián)操作。這類羥胺類化合物主要有：氨氧乙酸 aminoxy acetic acid或羧甲氧胺 carboxymethoxylamine或者鹽酸羥胺 酮基的類固醇分子中引入羧基 的操作步驟1、在200ml乙醇中，加入O-（羧甲基）羥胺 （O-（carboxyl）hydroxylamine ）和酮基半 抗原，使其濃度分別為10m mol/L和4m mol/L 2、加熱回流90分鐘3、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減少容積，然后加水至40ml，用乙醚抽提 4、用水洗滌乙醚抽提物，用 Na

12、2SO4干燥成白色粉末。（六）、其他半抗原的偶聯(lián) 雖含有游離基 團(tuán)，但因這些基團(tuán)對(duì)于維其生物活性十分重要，因 些不能直接用來(lái)與載體蛋白偶聯(lián)。制備雌二醇-6-肟的操作步驟a、 雌二醇二醋酸鹽的制備1、1g雌二醇溶于14ml吡啶及3.5ml醋酐中2、加熱回流1小時(shí)，冷卻后傾入冰水中。3、收集白色晶體，得產(chǎn)物約1.1g （熔點(diǎn)126到127度）b、雌二醇-6-酮-二醋酸鹽的制備4、雌二醇二醋酸鹽1.1g，滴加冰醋酸3.8ml溶解后加含 0.93g CrO3的含水冰醋酸 6.35ml (H2O:Hac=0.75:5.6) 5、室溫?cái)嚢?1小時(shí)，靜置 24 小時(shí)6、用水稀釋，用乙醚提取 4次7、用烝餾水

13、洗 2次&減壓蒸餾，得結(jié)晶油狀渣物。9、用90度烘干20分鐘，得粗制品約 500mg10、用11ml無(wú)水乙 醇溶解粗制品，再加1.1ml冰醋酸及1.5g吉納你特 T試劑(Girad T)，回流1小時(shí)。11、冷卻后，用冰 致冷的蒸餾水稀釋，用2.5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至6.0-6.2.12、用乙醚抽提 3次，棄去乙醚。13、水層用濃鹽酸酸化(鹽酸終濃度為1mol/L). 14、室溫靜置2小時(shí)。15、用乙醚抽提3次。16、合并乙醚 抽提液，用0.125mol/L碳酸鈉溶液洗1次，用蒸餾 水洗3次。17、用無(wú)水硫酸鈉脫水，蒸干。18、加 7ml醋酐，回流20分鐘。19、冷卻后傾入用冰致冷 的蒸餾水中，然后過(guò)濾、干燥得產(chǎn)物約176mg (熔點(diǎn)為162-166度)c、 二醇-6-酮的制備20、用 5.5ml 20 %的氫氧化鉀-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇- 6-酮-二醋酸鹽(176mg ,在室溫下于氮?dú)庵兴?4 小時(shí)。21、加蒸餾水稀釋，用乙醚抽提 3次。22、 在乙醚提取液中無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行脫水，蒸發(fā)干燥，得產(chǎn)物約60mg熔點(diǎn)為278-282度)d、雌二醇-6-肟的制備23、取雌二醇-6-酮50mg ,鹽酸羧