植物組織培養(yǎng)技術(shù)及其在育種中的應(yīng)用

1、現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁，共45頁（一）生物技術(shù)概念（一）生物技術(shù)概念 生物技術(shù)（生物技術(shù)（Biotechnology)，有時也稱，有時也稱生物工程（生物工程（Bioengineering）, 是指人們以是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的工程技現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的原理，按照預(yù)先術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的原理，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類產(chǎn)出所需產(chǎn)品。生物技術(shù)是一門綜合性類產(chǎn)出所需產(chǎn)品。生物技術(shù)是一門綜合性學(xué)科?，F(xiàn)代生物技術(shù)已成功地應(yīng)用于植物學(xué)科?，F(xiàn)代生物技術(shù)已成功地應(yīng)用于植物育種中。育種中?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二

2、頁，共45頁l基因工程（基因工程（Gene Engineering）l細胞工程（細胞工程（Cell Engineering ）l酶工程（酶工程（Enzyme Engineering ）l發(fā)酵工程（發(fā)酵工程（Fermentation Engineering ）l蛋白質(zhì)工程（蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering ）現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁，共45頁 細胞工程就是在細細胞工程就是在細胞水平研究開發(fā)、胞水平研究開發(fā)、利用各類細胞的工利用各類細胞的工程。亦即人們根據(jù)程。亦即人們根據(jù)科學(xué)設(shè)計改變細胞科學(xué)設(shè)計改變細胞的遺傳基礎(chǔ)，通過的遺傳基礎(chǔ)，通過無菌操作，大量培無菌操作，大量培養(yǎng)細胞、組織乃至養(yǎng)細

3、胞、組織乃至完整個體的技術(shù)。完整個體的技術(shù)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁，共45頁l分離基因的技術(shù)；分離基因的技術(shù)；l擴增基因的技術(shù)；擴增基因的技術(shù)；l將單一細胞擴增成細胞群體的技術(shù)；將單一細胞擴增成細胞群體的技術(shù)；l將一個生命體復(fù)制成一個與之完全相同將一個生命體復(fù)制成一個與之完全相同的新個體的過程；的新個體的過程；l將單一個體擴增成一個遺傳上完全相同將單一個體擴增成一個遺傳上完全相同的群體。的群體。l一個遺傳上來源完全相同的生物群體一個遺傳上來源完全相同的生物群體?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁，共45頁1、植物細胞的全能性（、植物細胞的全能性（Cell Totipotency） 一個植物細胞能產(chǎn)生一個完整植株一

4、個植物細胞能產(chǎn)生一個完整植株的固有能力稱之為細胞的全能性。的固有能力稱之為細胞的全能性?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁，共45頁2、植物離體分化的類型、植物離體分化的類型l無菌短枝型無菌短枝型l叢生芽增殖型叢生芽增殖型l器官發(fā)生型器官發(fā)生型l胚狀體發(fā)生型胚狀體發(fā)生型l原球莖發(fā)生型原球莖發(fā)生型現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁，共45頁3、植物組織培養(yǎng)的特點、植物組織培養(yǎng)的特點l培育材料經(jīng)濟；培育材料經(jīng)濟；l培養(yǎng)條件可人為控制；培養(yǎng)條件可人為控制；l生長周期短，繁殖率高；生長周期短，繁殖率高；l管理方便，利于自動化控制。管理方便，利于自動化控制。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁，共45頁5、植物組織培養(yǎng)的基本操作、植物組織培養(yǎng)的基本操作

5、l無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)l細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)l原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁，共45頁v接種用具的滅菌接種用具的滅菌 接種前，必須把用具放入接種室或箱內(nèi)，初用接種室或接種前，必須把用具放入接種室或箱內(nèi)，初用接種室或箱時要用甲醛（一般市售分析純的有效成份為箱時要用甲醛（一般市售分析純的有效成份為 36-38% 熏蒸熏蒸5小時以上再開紫外光燈照射小時以上再開紫外光燈照射40-60分鐘，以后在每次接種分鐘，以后在每次接種之前，把要接種的試管或三角瓶放入接種室（箱）內(nèi)，用之前，把要接種的試管或三角瓶放入接種室（箱）內(nèi)，用5%的煤酚瓶皂溶液即來蘇爾（一般市售的有效成份為的煤酚

6、瓶皂溶液即來蘇爾（一般市售的有效成份為47-53%）或）或 5% 的石灰炭酸液噴霧消毒，再打開紫外光的石灰炭酸液噴霧消毒，再打開紫外光燈照燈照20-40分鐘，這樣消毒后，再經(jīng)分鐘，這樣消毒后，再經(jīng)30-40分鐘便可進行接種。分鐘便可進行接種。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁，共45頁v接種材料的表面滅菌接種材料的表面滅菌 接種前花蕾或穗的徹底滅菌是杜絕污染的主要接種前花蕾或穗的徹底滅菌是杜絕污染的主要關(guān)鍵，先用關(guān)鍵，先用70-75%的酒精浸泡的酒精浸泡10-15秒鐘或用酒精秒鐘或用酒精棉球擦兩遍，初步殺死表面所帶的微生物，放在棉球擦兩遍，初步殺死表面所帶的微生物，放在10%的漂白粉液或飽和漂白粉液中浸泡的

7、漂白粉液或飽和漂白粉液中浸泡15-30分鐘殺菌，分鐘殺菌，然后用無菌水沖洗然后用無菌水沖洗2-3次。次。 消毒過的穗子或花蕾用消毒紗布包好，待取花藥消毒過的穗子或花蕾用消毒紗布包好，待取花藥接種，注意，穗子或花蕾的操作要在無菌條件下進接種，注意，穗子或花蕾的操作要在無菌條件下進行。行?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁，共45頁5、植物組織培養(yǎng)所需營養(yǎng)與環(huán)境條件、植物組織培養(yǎng)所需營養(yǎng)與環(huán)境條件（1）無機營養(yǎng)）無機營養(yǎng)大量元素：大量元素： 一般是指濃度大于一般是指濃度大于0.5mmol/L.氮氮(N) 、磷、磷(P) 、鉀、鉀(K) 、鈣鈣(Ca) 、鎂、鎂(Mg) 、硫、硫(S) 。微量元素：微量元素： 包

8、括鐵包括鐵(Fe) 、銅、銅(Cu) 、鉬、鉬(Mo) 、鋅、鋅(Zn) 、鈉、鈉(Na) 、錳、錳(Mn) 、鈷、鈷(Co) 、硼、硼(B) 、碘、碘(I)。（2）有機營養(yǎng)）有機營養(yǎng)維生素、肌醇、氨基酸、有機添加物。維生素、肌醇、氨基酸、有機添加物。（3）生長調(diào)節(jié)物）生長調(diào)節(jié)物生長素生長素：2，4 - D、奈乙酸、奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸（、吲哚丁酸（IBA）、吲哚）、吲哚乙酸乙酸(IAA) 。細胞分裂素細胞分裂素：激動素（：激動素（KT）、）、6-芐基氨基嘌呤（芐基氨基嘌呤（6BA） 、玉、玉米素（米素（ZT）。）。赤霉素赤霉素（GA） ：脫落酸（：脫落酸（ABA） 、乙烯利（、乙烯利（

9、CEDP）。）?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁，共45頁（4）瓊脂）瓊脂（5）能源和滲透壓）能源和滲透壓（6）其他成分）其他成分（7）溫度）溫度（8）光照（光強、光質(zhì)）光照（光強、光質(zhì)）培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)基的配制： 培養(yǎng)基母液的配制培養(yǎng)基母液的配制 ；配制培養(yǎng)基的步驟；配制培養(yǎng)基的步驟；培養(yǎng)基的分裝及滅菌。培養(yǎng)基的分裝及滅菌?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁，共45頁6、植物組織培養(yǎng)經(jīng)歷的五個階段：、植物組織培養(yǎng)經(jīng)歷的五個階段：（1）預(yù)備階段預(yù)備階段外植體的獲得；外植體的獲得；接種材料的消毒處理；接種材料的消毒處理；配制適宜的培養(yǎng)基；配制適宜的培養(yǎng)基；（2）誘導(dǎo)去分化階段誘導(dǎo)去分化階段（3）繼代增殖階段）繼代增殖階

10、段（4）生根成芽階段）生根成芽階段（5）移栽成活階段）移栽成活階段現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁，共45頁種質(zhì)資源保護；種質(zhì)資源保護；優(yōu)良品種快速繁殖；優(yōu)良品種快速繁殖；誘發(fā)和離體篩選突變體；誘發(fā)和離體篩選突變體；克服遠緣雜交困難；克服遠緣雜交困難；克服種子發(fā)育中的障礙；克服種子發(fā)育中的障礙；單倍體育種的技術(shù)環(huán)節(jié)單倍體育種的技術(shù)環(huán)節(jié)基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁，共45頁l單倍體的概念及其特點單倍體的概念及其特點l 只含有一套染色體組的生物體；只含有一套染色體組的生物體；l 被子植物的配子體世代。被子植物的配子體世代。矮小性；矮小性；不育性；不育性；全顯性。全顯性?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是

11、第十六頁，共45頁l單倍體植物的直接利用；單倍體植物的直接利用；l克服雜種分離，縮短育種年限；克服雜種分離，縮短育種年限；l快速獲得異花授粉植物的自交系；快速獲得異花授粉植物的自交系；l單倍體植物的誘變育種；單倍體植物的誘變育種；l克服遠緣雜種不孕性與不穩(wěn)定的現(xiàn)象；克服遠緣雜種不孕性與不穩(wěn)定的現(xiàn)象；現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁，共45頁（1）單倍體材料的采集）單倍體材料的采集 單倍體育種的首要問題是如何獲得大最的單倍單倍體育種的首要問題是如何獲得大最的單倍體植株。據(jù)現(xiàn)有的研究材料，用花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株。據(jù)現(xiàn)有的研究材料，用花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株有兩個途徑體植株有兩個途徑: 第一是在離體培養(yǎng)的花藥中

12、，花粉經(jīng)過類似胚第一是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉經(jīng)過類似胚胎發(fā)育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、曼陀胎發(fā)育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、曼陀羅等。羅等。 第二是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉形成愈傷組織，第二是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉形成愈傷組織，再從愈傷組織分化出單倍體植株。再從愈傷組織分化出單倍體植株?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁，共45頁（2）花藥的接種）花藥的接種l接種前的準(zhǔn)備工作接種前的準(zhǔn)備工作 接種和培養(yǎng)花藥是在無菌條件下進行的，所接種和培養(yǎng)花藥是在無菌條件下進行的，所用的一切用具必須徹底滅菌。用的一切用具必須徹底滅菌。l花粉發(fā)育時期的鑒定花粉發(fā)育時期的鑒定 適宜的花粉發(fā)育時期對于提高花粉誘

13、導(dǎo)愈傷組織適宜的花粉發(fā)育時期對于提高花粉誘導(dǎo)愈傷組織分化的頻率是很重要的，為此，進行花藥培養(yǎng)前，要分化的頻率是很重要的，為此，進行花藥培養(yǎng)前，要用顯微鏡進行花粉發(fā)育時期的鑒定。用顯微鏡進行花粉發(fā)育時期的鑒定。 經(jīng)顯微鏡檢查后，把花粉細胞的發(fā)育進期與花藥經(jīng)顯微鏡檢查后，把花粉細胞的發(fā)育進期與花藥或花序的外部形態(tài)聯(lián)系起來，找出花粉單核期或單核或花序的外部形態(tài)聯(lián)系起來，找出花粉單核期或單核期的花蕾或花序的外部形態(tài)標(biāo)志選取花藥進行接種培期的花蕾或花序的外部形態(tài)標(biāo)志選取花藥進行接種培養(yǎng)。養(yǎng)。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁，共45頁 誘導(dǎo)愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在誘導(dǎo)愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在愈傷

14、組織長到愈傷組織長到1-3毫米大小（如小米大）時，即可毫米大?。ㄈ缧∶状螅r，即可轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，促使分化長出植株。轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，促使分化長出植株。一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然會發(fā)生，如果先有根，以后不一定會出芽。因此會發(fā)生，如果先有根，以后不一定會出芽。因此，掌握芽分化的條件是十分重要的。，掌握芽分化的條件是十分重要的。 愈傷組織轉(zhuǎn)移培養(yǎng)工作是在無菌室或接種箱內(nèi)愈傷組織轉(zhuǎn)移培養(yǎng)工作是在無菌室或接種箱內(nèi)進行的，轉(zhuǎn)移后愈傷組織培養(yǎng)在進行的，轉(zhuǎn)移后愈傷組織培養(yǎng)在23-28恒溫室內(nèi)，每恒溫室內(nèi)，每日光照日光照9-11小時，可用

15、日光燈作輔助光，光強度在小時，可用日光燈作輔助光，光強度在2000勒克斯以上。勒克斯以上。 在轉(zhuǎn)移愈傷組織時，應(yīng)注意其極性，原來向在轉(zhuǎn)移愈傷組織時，應(yīng)注意其極性，原來向上的一但轉(zhuǎn)移后的一但轉(zhuǎn)移后仍應(yīng)向上，否則會影上的一但轉(zhuǎn)移后的一但轉(zhuǎn)移后仍應(yīng)向上，否則會影響生長，同時在轉(zhuǎn)移時，就避免沾帶過多的培養(yǎng)基響生長，同時在轉(zhuǎn)移時，就避免沾帶過多的培養(yǎng)基。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁，共45頁處理方式：處理方式：l試管內(nèi)進行；試管內(nèi)進行；l花粉植株定植后進行；花粉植株定植后進行；藥劑處理；藥劑處理；植株鑒定。植株鑒定。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁，共45頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁，共45頁（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜

16、交（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交 常規(guī)雜交育種由于物種間難以逾越常規(guī)雜交育種由于物種間難以逾越的天然屏障而舉步維艱。的天然屏障而舉步維艱。 科學(xué)家們受細科學(xué)家們受細胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功的啟示，胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功的啟示，逐漸將眼光轉(zhuǎn)向細胞融合，試圖通過這逐漸將眼光轉(zhuǎn)向細胞融合，試圖通過這種嶄新的手段沖破自然界的禁錮。種嶄新的手段沖破自然界的禁錮?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁，共45頁l原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體的概念 植物細胞原生質(zhì)體是指那些以去除植物細胞原生質(zhì)體是指那些以去除全部細胞壁的細胞。全部細胞壁的細胞。 此時，細胞外僅由此時，細胞外僅由細胞膜包裹，細胞膜包裹， 呈圓形只有在高滲溶液

17、中呈圓形只有在高滲溶液中才能相對穩(wěn)定。才能相對穩(wěn)定。 原生質(zhì)體經(jīng)適當(dāng)處理，可與其他細原生質(zhì)體經(jīng)適當(dāng)處理，可與其他細胞融合成新的體細胞。胞融合成新的體細胞?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁，共45頁比完整的細胞更容易獲得外來遺傳物質(zhì)，比完整的細胞更容易獲得外來遺傳物質(zhì)，為實現(xiàn)異源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了較好的為實現(xiàn)異源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了較好的實驗材料。實驗材料。原生質(zhì)體在一定條件下可以融合成雜種原生質(zhì)體在一定條件下可以融合成雜種細胞，開辟了一條新的育種途徑。細胞，開辟了一條新的育種途徑?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁，共45頁1892， J. A. Klerker 用機械法獲得原生質(zhì)體；用機械法獲得原生質(zhì)體；1960，

18、E.C. Cocking 用酶法首先從番茄根尖中分離出大用酶法首先從番茄根尖中分離出大量有活性的原生質(zhì)體并通過培養(yǎng)再生出細胞壁形成再量有活性的原生質(zhì)體并通過培養(yǎng)再生出細胞壁形成再生植株生植株;1960，G. Barski發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn), 題細胞原生質(zhì)體能融合在一起形題細胞原生質(zhì)體能融合在一起形成單核的、并能進行分裂的雜種細胞；成單核的、并能進行分裂的雜種細胞；1972，P.S.Carlon首次獲得煙草體細胞種間雜種。首次獲得煙草體細胞種間雜種。80s 此項技術(shù)在我國得到發(fā)展。此項技術(shù)在我國得到發(fā)展?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十六頁，共45頁l4. 原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備l（1）取材與滅菌）取材與滅菌（2

19、）酶解）酶解 (纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶) （3）分離）分離 （沉淀法、漂洗法、滴洗法）（沉淀法、漂洗法、滴洗法）（4）洗滌）洗滌（5）鑒定（形態(tài)觀測、活性鑒定）鑒定（形態(tài)觀測、活性鑒定）原生質(zhì)體的培養(yǎng)：原生質(zhì)體的培養(yǎng)：細胞壁再生；細胞壁再生；細胞分裂；細胞分裂；植株再生。植株再生?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁，共45頁l5. 原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體的融合v化學(xué)法誘導(dǎo)融合化學(xué)法誘導(dǎo)融合l按比例混合雙親原生質(zhì)體按比例混合雙親原生質(zhì)體- l滴加滴加PEG- l滴加高鈣高滴加高鈣高PH值溶液值溶液- l洗滌原生質(zhì)體溶液洗滌原生質(zhì)體溶液- l離心獲得原生質(zhì)體溶液離心獲得原生質(zhì)

20、體溶液-l篩選雜種細胞篩選雜種細胞-l再生雜種細胞。再生雜種細胞?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十八頁，共45頁v物理法誘導(dǎo)融合物理法誘導(dǎo)融合基本程序：基本程序：原生質(zhì)體的獲得；原生質(zhì)體的獲得；電擊融合；電擊融合；篩選雜種細胞；篩選雜種細胞；雜種細胞再生和完整雜種細胞再生和完整植株的形成。植株的形成?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十九頁，共45頁6. 融合細胞的培養(yǎng)鑒定與篩選融合細胞的培養(yǎng)鑒定與篩選l雜和細胞的顯微鏡鑒別；雜和細胞的顯微鏡鑒別；l互補法鑒定雜和細胞；互補法鑒定雜和細胞；l細胞與分子生物學(xué)法；細胞與分子生物學(xué)法；l植株形態(tài)的鑒別。植株形態(tài)的鑒別?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十頁，共45頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十一頁，共45頁

21、（三）人工種子（三）人工種子 人工種子即人為制造的種子，它人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素、及其他成分的人工膠囊。分、激素、及其他成分的人工膠囊。其具有種子的功能，可直接用于田間其具有種子的功能，可直接用于田間播種。播種?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十二頁，共45頁 1、人工種子的構(gòu)成人工種子的構(gòu)成 人工種皮人工種皮 胚胚 狀狀 體體 人工胚乳人工胚乳現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十三頁，共45頁2、人工種子的特點人工種子的特點：（1）可以不受環(huán)境條件的限制，周年進行生產(chǎn)；）可以不受環(huán)境條件的限制，周年進行生產(chǎn)；（2）經(jīng)人工無性繁殖產(chǎn)生，有利于保存該種系）經(jīng)人工無性繁殖產(chǎn)生，有利于保存該種系 的優(yōu)良性狀；的優(yōu)良性狀；（3）成本低，適于田間機械化生產(chǎn)；）成本低，適于田間機械化生產(chǎn)；（4）可根據(jù)需要調(diào)節(jié)胚乳成分。）可根據(jù)需要調(diào)節(jié)胚乳成分?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十四頁，共45頁3、人工種子的制備人工種子的制備（1）胚狀體的制備及其同步生長；）胚狀體的制備及其同步生長；（2）人工胚乳的制備；）人工胚乳的制備；（3）配制包埋劑及人工包埋。）配制包埋劑及人工包埋。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十五頁，共45頁人工種子包埋示意圖人工