胃癌分化程度與神經(jīng)分布相關(guān)性及癌細胞與神經(jīng)細胞相互作用的研究

1、胃癌分化程度與神經(jīng)分布相關(guān)性及癌細胞與神經(jīng)細胞相互作用的研究 10-09-13 14:43:00 編輯：studa20 作者：尹天泉 張米 劉海蓮 張洪偉 王百忍 段曉莉【摘要】 目的 研究胃癌組織中神經(jīng)纖維密度與癌分化程度的相關(guān)性及癌細胞與神經(jīng)細胞的相互作用。方法 取66例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本，GAP43染色標(biāo)記神經(jīng)纖維，Imagepro plus 6.0分析神經(jīng)纖維分布密度，比較不同分化程度胃癌組織內(nèi)神經(jīng)纖維密度的差異。用不同分化程度的胃癌細胞系與神經(jīng)細胞系交互條件培養(yǎng)，MTT檢測細胞增殖。結(jié)果 低分化胃癌組織中神經(jīng)纖維密度高于高分化胃癌組織(P0.05)；低分化胃癌細胞對神經(jīng)細胞增殖的促進作

2、用明顯高于高分化胃癌細胞(P0.05)。神經(jīng)細胞對兩種癌細胞均有促進作用。結(jié)論 胃癌的分化程度與神經(jīng)纖維的密度具有相關(guān)性，低分化胃癌神經(jīng)纖維密度高于高分化胃癌；低分化胃癌細胞更能促進神經(jīng)細胞的增殖，神經(jīng)細胞促進癌細胞的增殖。 【關(guān)鍵詞】 胃癌；神經(jīng)纖維；GAP43；分化程度 【Abstract】Objective To investigate correlations between nerve fiber density and pathological type in gastric cancer and interactions of cancer cells and nerve cel

3、ls. Methods Samples were obtained from the excisional tissues of 66 gastric cancer patients and stained by antiGAP43 antibodies. The density of nerve fibers was analyzed by Imagepro plus 6.0 software. The difference of PC12 cells proliferation in different conditioned cell culture medium and the pro

4、motion of PC12 cells to cancer cells were determined by MTT assay. Results The nerve fiber density in poorly differentiated gastric cancer was obviously higher than that in well differentiated gastric cancer. Poorly differentiated gastric cancer cells could better promote the proliferation of nerve

5、cells than the well differentiated gastric cancer cells did. Nerve cells could promote the proliferation of cancer cells. Conclusions Differentiation of gastric cancer is correlated with nerve density. Nerve fiber density of poorly differentiated gastric cancer is higher than that of well differenti

6、ated gastric cancer. Nerve cells could promote the proliferation of cancer cells. 【Key words】Gastric cancer; Nerve fiber; GAP43; Differentiation1960年代以前，醫(yī)學(xué)家們曾經(jīng)普遍認為，在腫瘤內(nèi)不存在神經(jīng)支配1。然而大量的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)和精神因素與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)2。同時，也不斷有關(guān)于腫瘤中存在神經(jīng)纖維束，腫瘤沿神經(jīng)纖維浸潤生長，腫瘤內(nèi)存在多種肽能神經(jīng)的報道。近年來國內(nèi)外許多關(guān)于腫瘤機制的研究結(jié)果顯示，腫瘤內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)的改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的

7、重要方面。更有學(xué)者認為嗜神經(jīng)生長已被視為癌癥的一個重要特征，神經(jīng)周圍浸潤 (PNI)是包括胃癌在內(nèi)的各種癌癥的重要轉(zhuǎn)移通道3。許多學(xué)者認為腫瘤中的神經(jīng)纖維是腫瘤在生長過程中包繞進去的，也有一些學(xué)者認為腫瘤中存在新生的神經(jīng)，對此，尚無定論。腫瘤中存在神經(jīng)纖維，已經(jīng)成為不爭的事實。然而，對于腫瘤中神經(jīng)存在的意義及其與癌細胞之間的相互作用，與癌組織分化程度及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，尚缺乏相關(guān)研究。本實驗旨在研究不同分化程度的胃癌組織中神經(jīng)分布差異，尋找胃癌病理分型與癌組織中神經(jīng)纖維生長的相關(guān)性，同時探討胃癌組織中神經(jīng)細胞與癌細胞的相互作用。1 材料與方法1.1 病例選擇手術(shù)標(biāo)本均由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院胃腸外科提

8、供。收集新鮮胃癌根治術(shù)患者的手術(shù)切除組織66例。其中男52例，女14例；年齡2676歲,平均58.1歲。患者術(shù)前均未接受過胃癌手術(shù)和抗腫瘤藥物治療或化療。手術(shù)后病理診斷均為胃腺癌，其中低分化腺癌38例、高分化腺癌28例。手術(shù)后臨床診斷均為進展期胃癌，大部分胃癌組織侵犯胃壁全層至漿膜層或漿膜外。病理報告查見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。1.2 方法切取手術(shù)切除的新鮮胃癌組織約1 cm大小被胃癌浸潤的全層組織塊；在同一患者手術(shù)切除標(biāo)本中，在距腫瘤邊緣5 cm以遠位置切取相似大小的未被腫瘤侵犯的全層胃組織作為對照的正常胃組織。用4%多聚甲醛固定1224 h，然后置于20%蔗糖溶液內(nèi)脫水24

9、 h以上，用冰凍切片機(LEICA 1800)-22條件下連續(xù)切片，貼于覆有明膠的載玻片上，片厚20 m，-20冰箱保存待用。取成對相鄰正常胃組織和胃癌組織切片分別進行HE染色、GAP43免疫組化ABC藍色法染色和GAP43免疫組化熒光法檢測。小鼠源性GAP43抗體為第四軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物研究所贈送單克隆抗體，生物素化的大鼠抗小鼠IgG及ABC試劑盒購于Sigma公司，兔抗小鼠IgGTexas Red 購于Molecular Probes公司?？贵w的稀釋度為一抗GAP43 1400、二抗生物素化的大鼠抗小鼠IgG 1400、熒光二抗兔抗小鼠IgGTexas Red 1100 稀釋于牛血清白蛋白稀

10、釋液，三抗生物素卵白素辣根過氧化物酶(ABC復(fù)合物)1500 稀釋于0.01 mol/L PBS(磷酸鹽緩沖液)。免疫組織化學(xué)ABC法染色封片后的切片于Olympus BX51顯微鏡明場采圖。免疫組織化學(xué)染色熒光法的組織切片用抗凍液(50%甘油)封片，避光置于4冰箱中，擇時OlympusBX51顯微鏡熒光采圖。取部分切片用做陰性對照，一抗用牛血清白蛋白稀釋液替代，二抗和三抗相同，染色步驟與上述相同。MKN45細胞系(低分化胃癌細胞系)和MKN28細胞系(高分化胃癌細胞系)由第四軍醫(yī)大學(xué)腫瘤生物學(xué)國家重點實驗室提供。復(fù)蘇后，第3代細胞用作實驗。原代復(fù)蘇細胞培養(yǎng)液為添加了10%胎牛血清的DMEM，

11、之后血清濃度逐代遞減，第1代7，第2代5，第3代3。待第3代細胞達到70%80%融合狀態(tài)時，倒掉培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍，加入無血清的DMEM，2 h后，將培養(yǎng)液(條件培養(yǎng)液)吸出，4冰箱保存，用于PC12細胞的培養(yǎng)。使用前，在條件培養(yǎng)液中加入血清，濃度為10%。 PC12細胞由第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程中心提供。復(fù)蘇后，第3代細胞用作實驗。原代復(fù)蘇細胞培養(yǎng)液為添加了10%胎牛血清的DMEM，待第3代細胞達到90融合時，用胰酶消化，1 000 r/min離心3 min，DMEM重懸、吹打均勻后，以2104/孔接種于96孔板中，共接種8列，每列接種8孔，空白孔加入含10%胎牛血清的DMEM、MTT、二甲基亞砜作為調(diào)零孔。接種完畢，前4列每孔加入160 l含10%血清的條件培養(yǎng)液，后4列每孔加入160 l含10%